與骨纖維異常增殖癥相關的MicroRNA分析.pdf

1、研究背景：骨纖維異常增殖癥為骨內纖維組織代替骨組織的增生過程。多見于兒童及青少年時期發(fā)病。女性多見,男女比例約為1:2?；颊哳M骨呈進行性腫大，青春期后可停止發(fā)展或速度減慢。多見于上頜骨及顴骨?？蔀閱喂切?，也可為多骨性。多骨性最常見于顱骨、頜骨，還可累及肋骨、骨盆及長骨。后期常引起頜面畸形及咬合功能障礙或眼球移位、鼻塞等癥狀。 目前對于骨纖維異常增殖癥的基礎研究集中在：骨形成蛋白基因等少數(shù)已經(jīng)報道的致病基因和突變位點，發(fā)現(xiàn)更多骨纖

2、維異常增殖癥致病基因及深入探索其致病機制是骨纖維異常增殖癥基礎研究的重要方向。本課題擬采用MicroRNA芯片探索與骨纖維異常增殖癥相關的基因，為后續(xù)研究提供科學依據(jù)。 MicroRNA是一種21-25nt長的單鏈小分子RNA。它廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質的短序列RNA.其本身不具有開放閱讀框(ORF)。成熟的miRNA，5，端有一個磷酸基團，3’端為羥基。miRNA5’端第一個堿基對U(尿苷)有強烈的傾向性，而對

3、G卻排斥，但第二到第四個堿基缺乏U。一般來講，除第四個堿基外，其他位置堿基通常都缺乏C。這些分子能夠與那些和它的序列互補的mRNA分子相結合，有時候甚至可以與特定的DNA片斷結合。這種結合的結果就是導致基因的沉默。這種方式是機體調節(jié)基因表達的一個重要策略。據(jù)推測，miRNA調節(jié)著人類三分之一的基因。 研究方法和研究結果： 本課題收集骨纖維異常增殖癥臨床病例共4例，同時選取2例正常對照。在基因芯片實驗中，我們將4例患者患病

4、組織中提取的RNA進行等量混合，2例正常對照也進行同樣處理。通過microRNA芯片，發(fā)現(xiàn)患者與正常對照之間存在的基因表達差異，然后討論這些存在差異表達的microRNA的潛在意義。 芯片用LuxScan10K/A.雙通道激光掃描儀(CapitalBio公司)進行掃描。之后利用LuxScan3.0圖像分析軟件(CapitalBio公司)對芯片圖像進行分析，把圖像信號轉化為數(shù)字信號，再利用SAM軟件進行統(tǒng)計比較，我們發(fā)現(xiàn)，在A1樣

5、品中有22個microRNA表達明顯上調，17個microRNA表達明顯下調。在所有表達上調的microRNA中，mir-34a/b在病例中表達上調最為明顯。而在表達下調的microRNA中，mir-1和mir-133a/b是下調最明顯的3個microRNA。 獲得以上基因芯片數(shù)據(jù)以后，再次提取正常對照及患者組織的RNA，并對提取的RNA進行定性、定量分析，采用Northernblot方法對芯片結果進行驗證。結果表明，mir-3

6、4a/b、mir-181b和mir-20b在病例樣本中表達上調明顯；mir-1和mir-133a/b在病例樣本中下調顯著，與芯片結果相符。 在證實上述結果以后，對表達改變顯著的microRNA進行生物信息學分析，相關數(shù)據(jù)和資料顯示，mir-34a/b可以通過影響細胞周期來抑制細胞的增殖，但是軟件提示的相關基因與骨形成關系不明顯。mir-181b和mir-20b均與VEGF表達相關，VEGF全稱是血管內皮生長因子(Vascular

7、endothelialgrowthfactor)，是PDGF/VEGF生長因子家族的成員之一，主要在內皮細胞中發(fā)揮功能，其作用包括間接增加血管滲透性；誘導血管新生、血管發(fā)生和內皮細胞生長；促進細胞遷移、抑制細胞凋亡。在對骨纖維異常增殖癥患者的手術中，有一個顯著特點：患病組織局部出血顯著多于正常組織，提示患者的基因表達異常中，可能存在與血管生成、發(fā)育相關的異常。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強、特異性最高的促血管生成因子。所以在后續(xù)實驗中，選

8、取VEGF作為研究靶點。 實驗選取4位患者的組織和血清，通過WesternBlot、RT-PCR和ELISA實驗驗證了患者VEGF的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)：患者VEGF水平在蛋白質水平和mRNA水平均顯著升高。這一點改變可以解釋目前在手術中發(fā)現(xiàn)的患者手術局部血管豐富、出血較多的表現(xiàn)。 結論： 實驗首先通過microRNA基因芯片確定了骨纖維異常增殖癥患者與正常對照之間microRNA的表達差別，之后應用Norther

9、nblot方法對實驗結果進行驗證。結果發(fā)現(xiàn)mir-34a/b、mir-181b和mir-20b在病例樣本中表達上調明顯；mir-1和mir-133a/b在病例樣本中下調明顯，這些特異改變可以作為以后基因診斷和基因治療的研究靶點。 在確定表達改變顯著的microRNA以后，對這些microRNA進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)mir-181b和mir-20b均與VEGF表達相關，實驗從組織水平、血清水平驗證了患者組織中和血液中均存在VEG