煙草T--DNA插入突變體的抗病篩選與大豆疫霉菌PsAAT3的功能研究.pdf

1、煙草經(jīng)濟價值高、種質(zhì)資源豐富、各個品系間雜交容易、易于遺傳轉(zhuǎn)化，是植物病理學領域廣泛應用的模式植物。普通煙為異源四倍體植物，含T和S兩個基因組，基因組約為4.5 Gb，重復序列比例高。目前，普通煙草及其兩個祖先種絨毛狀煙草(N.tomentosiformis)扣林煙草（N.sylvestris）的全基因組序列草圖已經(jīng)繪制完成，這為反向遺傳學研究煙草基因功能奠定了基礎。煙草突變體庫的構(gòu)建與篩選是挖掘功能基因最為直接有效的一種主要方法。本研

2、究以中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術所提供的煙草T-DNA激活標簽突變體庫為材料，創(chuàng)造性地利用兩種化合物對文庫進行初篩以彌補抗病表型篩選工作量大的缺點，獲得了一批對兩種化合物敏感性發(fā)生改變的突變體，并對其中一個材料進行了較為系統(tǒng)的研究，取得的主要結(jié)果如下:
　　獲得了16個對水楊酸敏感性改變的煙草突變體。水楊酸是介導植物抗病性的重要信號傳導物質(zhì)。突變體對水楊酸處理耐受度改變通常是由于水楊酸介導的抗病信號通路關鍵基因突變引起的，我們對7776

3、份突變體材料進行了初篩、復篩與表型驗證等環(huán)節(jié)，獲得了10個對水楊酸耐受性增強的突變體，6個對水楊酸更為敏感的突變體。
　　獲得了9個抗氧化脅迫能力發(fā)生改變的突變體。AT(Amitrole;俗名殺草強)是植物過氧化氫酶的不可逆專一性抑制劑，在生產(chǎn)中被應用為內(nèi)吸傳導型滅生性莖葉處理除草劑，通過葉片和根吸收并在體內(nèi)傳導。因此利用AT處理是篩選抗氧化脅迫突變體簡單有效的方法，對其研究也有望獲得抗病關鍵基因。對7776份材料進行篩選，發(fā)現(xiàn)3

4、個突變體對AT耐受性顯著增強，6個突變體對AT的敏感性減弱。對上述獲得的25個突變體進行陽性鑒定發(fā)現(xiàn)均為T-DNA插入突變體。接種實驗表明，有多個的抗病能力發(fā)生改變，這為進一步獲得抗病關鍵基因提供了研究材料。
　　一個對AT敏感突變體的抗病性增強。對編號為21AS的煙草突變體進行了進一步的研究，該突變體對AT更敏感。形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，21AS的葉片呈卵圓形、葉面不平整、葉尖圓鈍。接種灰葡萄孢霉和寄生疫霉兩種病原菌發(fā)現(xiàn)，該突變體抗病性顯

5、著提高。選擇兩個防衛(wèi)相關基因(NtGST1和NtCAT1)對其轉(zhuǎn)錄水平進行了比較。發(fā)現(xiàn)在侵染過程中NtGST1呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢，NtCAT1下調(diào)表達，且21AS中兩個基因的表達水平高于WT。用flg22處理，觀察到突變體的活性氧積累水平在處理前期明顯下降。有意思的是，我們還發(fā)現(xiàn)一系列的植物細胞死亡激發(fā)子處理后，細胞死亡發(fā)生水平明顯降低。上述結(jié)果說明該突變體的抗病能力，防衛(wèi)反應發(fā)生水平以及抗氧化脅迫能力與野生型相比發(fā)生了明顯改變，但其具體