血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞整合素β-,3-表達(dá)的研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)是嚴(yán)重威協(xié)人類健康的常見病和多發(fā)病。目前關(guān)于As的研究多集中于血管內(nèi)皮細(xì)胞，認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞功能不良(endotheliumdysfunction)是As發(fā)生的起始和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。黏附分子表達(dá)增高是內(nèi)皮細(xì)胞功能不良的特征之一，導(dǎo)致單核細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附異常增強(qiáng)，啟動(dòng)As的發(fā)生發(fā)展。 血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(reni

2、n-angiotensinsystem，RAS)主要的效應(yīng)肽。它在高血壓發(fā)病機(jī)制中的作用比較明確。越來越多的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AngⅡ也是As的危險(xiǎn)因素。因此，研究AngⅡ?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmoothmusclecells，VSMCs)基因轉(zhuǎn)錄的影響有助于闡明高血壓和As共同的發(fā)病機(jī)制。 整合素(integrin)是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與胞外基質(zhì)相互作用的一類黏附分子。整合素族在As中的作用日益受到重

3、視。αvβ3屬于β3類整合素族，無論是內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的αVβ3分子還是VSMCs表達(dá)的αvβ3分子，在As的發(fā)生發(fā)展中都起著重要的作用。內(nèi)皮細(xì)胞表面的αvβ3是介導(dǎo)血小板與內(nèi)皮細(xì)胞黏附的重要分子。VSMCs表面的αvβ3是介導(dǎo)VSMC向內(nèi)膜遷移的重要分子。已知整合素β3(integrinbeta3，Intb3)基因的轉(zhuǎn)錄量決定了細(xì)胞表面αvβ3的分子數(shù)，而致病因素如何調(diào)控Intb3基因的轉(zhuǎn)錄，目前尚未見到在人類細(xì)胞上的研究成果。

4、本室前期的工作曾觀察到人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcell,HUVECs)表面αvβ3表達(dá)上調(diào)介導(dǎo)了高糖、高胰島素、高胰島素原、腫瘤壞死因子作用下血小板與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，并且從蛋白水平、mRNA水平證實(shí)了AngⅡ促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表面Intb3的表達(dá)。本研究工作首先用RT-PCR方法重復(fù)了AngⅡ誘導(dǎo)HUVECsIntb3表達(dá)。根據(jù)已知的研究結(jié)果，AngⅡ致As的主要機(jī)制之一是通過增強(qiáng)血管壁還原

5、型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reducedformofnicotinamide-adeninedinucleotidephosphate,NADPH，還原型輔酶Ⅱ)的活性，促進(jìn)氧應(yīng)激。為了了解AngⅡ誘導(dǎo)HUVECs上Intb3表達(dá)的作用是否有氧應(yīng)激的參與，本研究工作用RT-PCR方法觀察了兩種抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)和維生素E(VitaminE，VE)對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)作用的影響。同時(shí)構(gòu)建了In

6、tb3基因5’上游調(diào)控區(qū)不同長(zhǎng)度熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入HUVECs，觀察5’上游序列在AngⅡ?qū)?nèi)皮細(xì)胞表面Intb3基因轉(zhuǎn)錄中的調(diào)控作用。 β-雌二醇和α-玉米赤霉醇(α-zearalanol，α-ZAL)能直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)節(jié)黏附分子的表達(dá)。β-雌二醇和α-ZAL能否調(diào)節(jié)HUVECs上Intb3基因的表達(dá)?本項(xiàng)研究用RT-PCR方法觀察了不同濃度的β-雌二醇和α-ZAL對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表面Int

7、b3基因轉(zhuǎn)錄的影響。并且用一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOsynthase，NOS)阻斷劑和雌激素受體阻斷劑，觀察了對(duì)β-雌二醇和α-ZAL效應(yīng)的干擾作用。本項(xiàng)研究還觀察了β-雌二醇和α-ZAL對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的帶有NF-κB結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒表達(dá)的影響，以及雌激素受體阻斷劑的作用。 VSMCs的遷移是As重要的發(fā)病機(jī)制之一。AngⅡ能夠促進(jìn)VSMCs的遷移。然而，AngⅡ能否激活VSMCsI

8、ntb3轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而引起VSMC的遷移，目前國(guó)內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道。為此，本項(xiàng)研究采用競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR方法觀察了不同時(shí)間和不同劑量的AngⅡ?qū)θ四殑?dòng)脈平滑肌細(xì)胞(humanumbilicalarterysmoothmusclecells，HUASMCs)表面Intb3基因表達(dá)的影響。 通過上述實(shí)驗(yàn)取得如下結(jié)果：1.10-6MAngⅡ作用4小時(shí)HUVECsIntb3mRNA的表達(dá)量是對(duì)照組的250.13％(p＜0.001)。氧自由基清

9、除劑NAC可完全抑制AngⅡ的作用(p＜0.01)。AngⅡ分別誘導(dǎo)熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒PGL3-Intb3-1483/+125、PGL3-Intb3-900/+125、PGL3-Intb3-327/+125和PGL3-Intb3-74/+104的熒光素酶活性分別是對(duì)照組的175.47％、115.57％、95.28％和95.45％。抗氧化劑NAC完全抑制了AngⅡ誘導(dǎo)PGL3-Intb3-1483/+125報(bào)告基因質(zhì)粒的熒光素酶活性(p

10、＜0.05)。 2.AngⅡ誘導(dǎo)HUVECs帶有NF-κB結(jié)合序列質(zhì)粒熒光素酶活性是對(duì)照組的156.47％(p＜0.05)。IKKα-KM、IKKβ-KM和NIK-KM組完全抑制了該質(zhì)粒熒光素酶的表達(dá)(p＜0.01)。 3.AngⅡ誘導(dǎo)HUVECsPGL3-Intb3-1483/+125質(zhì)粒熒光素酶活性是對(duì)照組的176.31％(p＜0.05)。IKKα-KM、IKKβ-KM和NIK-KM組完全抑制了該質(zhì)粒熒光素酶表達(dá)(p

11、＜0.01)。 4.10-6M、10-7M、10-8Mβ-雌二醇作用于HUVECs，分別抑制AngⅡ作用的95％、63％和56％。10-6M、10-7M、10-8Mα-ZAL作用于HUVECs，分別抑制AngⅡ作用的143％(p＜0.05)、107％(p＜0.05)和80％。在上述濃度，α-ZAL的作用平均強(qiáng)于β-雌二醇1.54倍。NOS抑制劑和雌激素受體抑制劑不能阻斷上述抑制作用。 5.10-6Mβ-雌二醇和α-ZAL

12、可完全抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HUVECs含NF-κB位點(diǎn)質(zhì)粒熒光素酶的表達(dá)(β-雌二醇，p＜0.05；α-ZAL，p＜0.01)。ICI處理組對(duì)該抑制作用無明顯影響。 6.2×10-10M、2×10-9M、2×10-8M、2×10-7M、2×10-6MAngⅡ誘導(dǎo)HUASMCsIntb3mRNA表達(dá)分別是對(duì)照組的102.72％、114.47％、116.65％、119.88％(p＜0.05)和122.01％(p＜0.05)。2×10-

13、8MAngⅡ分別作用0.5小時(shí)、2小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、18小時(shí)、24小時(shí)的誘導(dǎo)作用分別是對(duì)照組的107.94％、116.95％、125.10％、144.42％、158.36％和168.45％。 綜上所述，本研究工作進(jìn)一步印證了我室以往關(guān)于AngⅡ調(diào)控HUVECsIntb3基因表達(dá)的結(jié)果。成功構(gòu)建了四個(gè)含Intb3基因不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子區(qū)的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，并在此基礎(chǔ)上首次發(fā)現(xiàn)AngⅡ誘導(dǎo)HUVECsIntb3表達(dá)上調(diào)的機(jī)制