高糖所致大鼠血管平滑肌細胞和人臍靜脈內皮細胞損傷以及蛋白質硝化研究.pdf

1、糖尿病對身體的危害主要來自高糖導致的多種并發(fā)癥，在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中，氧化應激發(fā)揮著重要的作用。伴隨著高糖所導致的氧化應激的發(fā)生，過量產(chǎn)生的O2.-降低NO的生物活性，同時生成更強的氧化劑，如過氧亞硝基陰離子（ONOO-），進而損傷蛋白質生成3-硝基酪氨酸（3-NT）。目前已在許多糖尿病并發(fā)癥中發(fā)現(xiàn)3-NT的存在，但并沒有對其機理進行系統(tǒng)的研究。本論文主要對高糖和外源性硝化試劑（hemin-nitrite-H2O2和SIN-1）作

2、用人臍靜脈內皮細胞（ECV304）以及大鼠血管平滑肌細胞（VSMC）后所致細胞氧化損傷進行了研究，觀察蛋白質硝化反應是否進一步加重了細胞損傷的程度。同時我們還觀察了高糖和外源性硝化導致的細胞硝化蛋白之間的異同。所取得的主要結果如下： 1、高糖導致人臍靜脈內皮細胞（ECV304）氧化損傷以及引起蛋白質硝化內皮功能喪失以及進一步的損害在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。在高糖導致的內皮細胞損傷過程中，蛋白質酪氨酸硝化參與

3、其中。有關高糖導致人臍靜脈內皮細胞（ECV304）發(fā)生蛋白質硝化反應的研究還很少。用終濃度分別為30 mM和40 mM的D-葡萄糖作用ECV304細胞72 小時，通過檢測細胞存活率、測定脂質過氧化水平、熒光檢測胞內谷胱甘肽、熒光觀察胞內活性氧、毛細管電泳檢測胞內和胞外活性氮含量、凝膠電泳以及蛋白印跡分析細胞蛋白質硝化等觀察高糖所導致的氧化損傷情況。經(jīng)過高糖作用72 小時后，發(fā)現(xiàn)高糖可以導致ECV304發(fā)生嚴重的氧化損傷，且有劑量依賴性。

4、高糖所導致的氧化損傷表現(xiàn)在細胞存活率降低、丙二醛（MDA）的含量增加、谷胱甘肽（GSH）的含量降低、細胞內活性氧（ROS）的含量增加以及一氧化氮（NO）及其代謝產(chǎn)物的含量（包括增加細胞內亞硝酸鈉和培養(yǎng)基中硝酸鈉含量）增加。實驗結果還表明高糖可以導致ECV304細胞產(chǎn)生硝化蛋白，主要發(fā)生在分子量為66 kDa、50 kDa、43 kDa、34 kDa、30 kDa和23 kDa的蛋白上。通過對高糖作用ECV304 進行研究后發(fā)現(xiàn)，體內高糖

5、可以導致內皮細胞發(fā)生嚴重的氧化損傷，并且推斷蛋白質硝化反應參與了氧化損傷的過程。2、高糖導致大鼠血管平滑肌細胞（VSMC）氧化損傷以及引起蛋白質硝化高糖可以導致血管平滑肌細胞產(chǎn)生大量活性氧，進而在氧化應激狀態(tài)下可能會引起細胞內發(fā)生蛋白質酪氨酸硝化。目前尚無高糖與平滑肌細胞蛋白質硝化的相關性研究。用終濃度分別為30 mM和40 mM的D-葡萄糖作用大鼠血管平滑肌細胞（VSMC）3d和7d，通過檢測細胞存活率、熒光檢測胞內谷胱甘肽、熒光觀察

6、胞內活性氧、毛細管電泳檢測胞內活性氮含量、凝膠電泳以及蛋白印跡分析細胞蛋白質硝化等觀察高糖所導致的氧化損傷情況。結果表明，高糖以終濃度為30 mM和40 mM分別作用VSMC細胞3d和7d 后，可以顯著增加細胞的增殖、誘發(fā)細胞產(chǎn)生氧化損傷（包括降低GSH 含量以及增加細胞內活性氧ROS的含量）、導致VSMC中活性氮生成量增加，并證實高糖可以導致細胞內產(chǎn)生蛋白質的酪氨酸硝化，硝化主要發(fā)生在分子量為55 kDa、30 kDa、26 kDa和

7、20 kDa的蛋白上。在高糖導致的細胞氧化損傷過程中，氧化損傷的程度隨著高糖濃度和作用時間的增加而加重。 3、高糖和外源性硝化試劑（hemin-nitrite-H2O2和SIN-1）所致細胞蛋白質硝化有一定差別糖尿病并發(fā)癥的病理過程是復雜的，而導致蛋白質發(fā)生硝化反應的途徑又是多樣的。鐵卟啉或者某些含鐵卟啉過氧化酶催化NO2-—H2O2蛋白質硝化反應在病理條件下是比ONOO-更容易發(fā)生的。有關高糖所導致的細胞蛋白質硝化和外源性硝化

8、試劑所導致的細胞蛋白質硝化之間的差別研究的很少。分別用高糖和外源性硝化試劑（hemin-nitrite-H2O2和SIN-1）作用ECV304和VSMC細胞72 小時，通過檢測細胞存活率、凝膠電泳以及蛋白印跡分析細胞蛋白質硝化等觀察高糖和外源性硝化試劑所導致的細胞氧化損傷。 研究結果表明：（1）蛋白質硝化可以加重細胞損傷的程度；（2）對某些蛋白質來說，高糖所導致的蛋白質硝化現(xiàn)象同其它外源性硝化試劑（如hemin-nitrite-