中國(guó)人MEN2A家系RET原癌基因突變的分子篩查及五肽胃泌素激發(fā)試驗(yàn)的臨床意義.pdf

1、多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤綜合征(Multipleendocrineneoplasiasyndrome,MEN)是指在同一患者先后或同時(shí)發(fā)生兩個(gè)或兩個(gè)以上的內(nèi)分泌腺腫瘤(或增生)，根據(jù)病因及腫瘤的組合不同，MEN綜合征又分為MEN-1型和MEN-2型。多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤2型(MEN2)的主要特征是：甲狀腺C細(xì)胞增生或甲狀腺髓樣癌(Medullarythyroidcarcinoma,MTC)、腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤和甲狀旁腺增生或腺瘤。按其表型可以分為三種

2、亞型MEN2A、MEN2B、家族性甲狀腺髓樣癌(Familialmedullarythyroidcarcinoma，F(xiàn)MTC)及兩種變異型：先天性巨結(jié)腸癥(Hirschsprung病)和苔蘚樣皮膚淀粉樣沉著癥。在MEN2A患者中，約95％有甲狀腺髓樣癌，50％的患者伴有嗜鉻細(xì)胞瘤，20％伴有甲狀旁腺增生或腺瘤。 MEN2是一種常染色體顯性遺傳性疾病，其外顯率幾乎高達(dá)100％。MEN2的發(fā)病與ret原癌基因突變有關(guān)。自1993年國(guó)

3、外首次報(bào)道MEN2患者的RET基因?qū)W突變以來(lái)，共有超過(guò)100個(gè)位點(diǎn)突變的報(bào)告，MEN2A的突變主要集中在其中8個(gè)位點(diǎn)上。國(guó)內(nèi)對(duì)MEN2A的關(guān)注多為病例報(bào)道，分子遺傳學(xué)的研究尚不多見(jiàn)。本研究的目的是通過(guò)對(duì)2個(gè)臨床擬診MEN2A的先證者及其一級(jí)親屬的RET基因進(jìn)行直接測(cè)序，尋找該2個(gè)家系可能存在的RET基因突變，以探尋MEN2A的分子遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制，并行五肽胃泌素激發(fā)試驗(yàn)，評(píng)估其在MEN2A的診療中的指導(dǎo)意義。 材料與方法1.研究對(duì)

4、象：家系1：1)先證者：40歲女性，漢族；發(fā)病年齡29歲；因發(fā)作性多汗、心悸4年入我院。體格檢查：心率86次/分；血壓160/100mmHg；降鈣素CT1238.7ng/l。影像學(xué)檢查：“雙側(cè)腎上腺腫物”、“甲狀腺多發(fā)腺瘤或腺癌”。治療情況：1993年行“雙側(cè)腎上腺腫瘤切除術(shù)”及“甲狀腺左葉全切術(shù)，右葉次全切除術(shù)”，病理示“腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤”、“甲狀腺髓樣癌”。1995年、2000年及2002年3次因MTC復(fù)發(fā)并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，行甲狀腺

5、全切術(shù)并頸淋巴結(jié)清掃術(shù)。 2)先證者弟弟：33歲男性，漢族；發(fā)病年齡33歲；因發(fā)現(xiàn)血糖升高1年余胸悶心悸3月余入我院。體格檢查：心率83次/分，血壓132/68mmHg。鈣2.2mmmol/l，磷1.28mmol/l，iPTH49.99pg/ml(正常值11～55pg/ml)，CT16.10pmol/l(正常＜38.86pmol/l)，24h尿VMA47.2umol/24h，2h尿VMA/Cr=0.26。影像學(xué)檢查：CT示“雙側(cè)

6、腎上腺區(qū)腫塊”、“右側(cè)甲狀腺內(nèi)鈣化、左側(cè)甲狀腺內(nèi)低密度病灶”。治療情況：2003-10-17行雙側(cè)腎上腺切除術(shù)，病理示“腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤”。 家系21)先證者：45歲男性，漢族；發(fā)病年齡26歲；陣發(fā)性血壓升高伴心悸頭痛2年余入我院。體格檢查：血壓120～170/86～100mmHg,心率80次/分；生化檢查：鈣2.38mmmol/l,磷1.38mmol/l，iPTH＜20pg/ml，24hVMA84.0umol/24h。影像學(xué)檢

7、查：“右腎上腺腫物”。治療情況：1982年行右側(cè)腎上腺切除術(shù)，病理活檢示“腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤”；1990發(fā)現(xiàn)左側(cè)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，行“左側(cè)腎上腺腫物切除術(shù)”；1993因發(fā)現(xiàn)頸部腫物6月余再次入院；體格檢查：甲狀腺Ⅱ度腫大，右側(cè)頸部捫及0.5*0.5大小淋巴結(jié)；頸部CT示“雙側(cè)甲狀腺腺瘤”。行“甲狀腺左葉全切，右葉近全切術(shù)”，病理活檢示“甲狀腺髓樣癌”。1996年，甲狀腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)，行“右頸淋巴結(jié)清掃術(shù)”。 2)先證者兒子：18歲男

8、性，無(wú)相關(guān)主訴及體征，生化檢查示：降鈣素CT3006.55ng/l(正常值＜132ng/l)；患者未行進(jìn)一步生化、影像學(xué)檢查。 2.實(shí)驗(yàn)方法1)取外周靜脈血提取2個(gè)家系先證者及其家系成員的基因組DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，擴(kuò)增先證者RET原癌基因的21個(gè)外顯子，進(jìn)而對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與Pubmed上公布的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比較分析，從而判定變異的位點(diǎn)及編碼氨基酸序列的變化，測(cè)得突變所在的外顯子后，將其親屬

9、相應(yīng)外顯子的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。 2)五肽胃泌素激發(fā)實(shí)驗(yàn)及降鈣素的測(cè)定：禁食狀態(tài)下靜脈推注0.0μg/kg五肽胃泌素(稀釋于生理鹽水中)，在10s推完。于注射前及注射后2、5、10、15、20min分別采血標(biāo)本一次，測(cè)降鈣素(CT)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論：1.RET原癌基因C634雜合錯(cuò)義突變的測(cè)定：測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，家系1先證者及其弟的exon11編碼634密碼子的雜合錯(cuò)義突變Cys→Arg(TGC→CGC)；家系2先證者及其子的

10、exon11編碼634密碼子的雜合錯(cuò)義突變Cys→Tyr(TGC→TAC)。C634R和C634Y突變國(guó)外已有報(bào)道，并證實(shí)了這一位點(diǎn)突變導(dǎo)致RET受體蛋白二聚化，自身酪氨酸激酶活性異常激活，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖及腫瘤發(fā)生。 2.RET原癌基因外顯子多態(tài)性的測(cè)定：家系1先證者及其弟存在A45A和L769L雜合變異；家系2先證者及其子存在A45A雜合變異；兩處多態(tài)性國(guó)外曾多次報(bào)道過(guò)，均為單個(gè)堿基改變但氨基酸編碼相同，因而未影響受體蛋白的

11、表達(dá)。 3.基因型與表型的差異：兩個(gè)家系均為C634位點(diǎn)突變，但兩個(gè)家系臨床表現(xiàn)存在差異，提示除C634位點(diǎn)突變外，可能存在其他因素影響表型，如環(huán)境因素或基因修飾作用等。 4.五肽胃泌素激發(fā)試驗(yàn)結(jié)果：正常志愿者組基礎(chǔ)CT值均低于60ng/l，激發(fā)后CT峰值均低于90ng/l；2名先證者基礎(chǔ)CT值分別高達(dá)1351.7ng/l和8567.65ng/l，激發(fā)后CT峰值高達(dá)14629.8ng/l和23325.8ng/l，提示MT

12、C術(shù)后復(fù)發(fā)；家系1先證者之弟及家系2先證者之子基礎(chǔ)CT值分別為400.49ng/l和3006.55ng/l，激發(fā)后CT峰值分別為1268.47ng/l和4808.63ng/l，均顯著升高，提示已發(fā)生MTC。 結(jié)論：1.本研究中發(fā)現(xiàn)2個(gè)家系先證者及其部分親屬RET原癌基因exon11的C634R和C634Y雜合錯(cuò)譯突變，我們認(rèn)為是引起2個(gè)家系MEN2A發(fā)病的主要原因。 2.五肽胃泌素激發(fā)試驗(yàn)是發(fā)現(xiàn)MTC起病的有效手段；是檢