兩個(gè)多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤病2A型家系RET原癌基因突變方式的研究及相關(guān)臨床特征比較.pdf

1、多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤病2A型(MEN2A)是多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤病(Multiple endocrine neoplasia MEN)的一種亞型，為一種常染色體顯性遺傳性腫瘤綜合征，發(fā)病率約1/3萬(wàn)。MEN可分為MEN1和MEN2。MEN2A，又稱(chēng)為Sipple綜合征，占MEN2的60％，主要表現(xiàn)為甲狀腺髓樣癌(MTC)、嗜鉻細(xì)胞瘤(PHEO)和甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥(HPT)。幾乎所有的MEN2A患者出現(xiàn)甲狀腺髓樣癌，50％出現(xiàn)嗜鉻細(xì)胞瘤，15％

2、～30％出現(xiàn)甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥(增生或腺痛)；MEN2B主要表現(xiàn)為甲狀腺髓樣癌、黏膜神經(jīng)纖維瘤和嗜鉻細(xì)胞瘤；此外，MEN2還有幾種特殊類(lèi)型，包括家族性甲狀腺髓樣癌(FMTC)、MEN2A合并皮膚苔蘚樣淀粉樣變、MEN2A或FMTC合并先天性巨結(jié)腸。自1993年Donis-Keller等發(fā)現(xiàn)RET原癌基因突變引致MEN2A后，目前全世界報(bào)道的所有MEN2家系均為RET原癌基因突變所致，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)RET原癌基因突變類(lèi)型與MEN2的臨床表

3、現(xiàn)形式相關(guān)。本研究對(duì)兩個(gè)明確為MEN2A家系中的患病成員及大部分其他家庭成員進(jìn)行相關(guān)基因檢測(cè)，以期明確這兩個(gè)家系RET原癌基因的突變方式，并對(duì)兩個(gè)家系的相關(guān)臨床表現(xiàn)進(jìn)行比較。為開(kāi)展單基因突變疾病的診斷提供思路。 研究目的: 探討兩個(gè)多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤病2A型(MEN2A)家系的RET原癌基因突變方式和相關(guān)臨床特征。通過(guò)對(duì)兩個(gè)MEN2A家系的分析，為開(kāi)展單基因突變疾病的診斷提供思路。 研究方法: 一．研究對(duì)象

4、 1.家系1 1.1先證者(Ⅱ：13)：男，37歲，經(jīng)手術(shù)病理檢查診斷為雙側(cè)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤。術(shù)后1個(gè)月患者被診斷甲狀腺髓樣癌，手術(shù)后病理提示甲狀腺髓樣癌。分別于術(shù)后5個(gè)月和1年兩次復(fù)查甲狀旁腺B超正常，血清鈣磷、血降鈣素(CT)、血甲狀旁腺激素(iPTH)、血甲氧基腎上腺素(MN)、甲氧基去甲腎上腺素(NMN)水平均正常，癌胚抗原(CEA)陰性。 1.2先證者姐姐(Ⅱ：12)： 女，40歲，經(jīng)手術(shù)病理證

5、實(shí)為雙側(cè)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤。術(shù)后1年復(fù)查甲狀腺、甲狀旁腺B超正常，血清鈣磷、MN和NMN水平正常，CEA陰性；但血CT及iPTH水平升高。 1.3先證者弟弟(Ⅱ：15)： 男，35歲，外院診斷為甲狀腺髓樣癌，行手術(shù)切除(具體術(shù)式不詳)，病理證實(shí)為甲狀腺髓樣癌。術(shù)后行雙側(cè)腎上腺CT發(fā)現(xiàn)右側(cè)腎上腺腺瘤，左側(cè)腎上腺結(jié)節(jié)樣增生，未予治療。術(shù)后9個(gè)月查血清鈣磷、MN、NMN及血CT在正常范圍，但血iPTH水平升高。 1.4家

6、系1中其他家庭成員情況： 先證者弟弟(Ⅱ：17)，男，33歲，甲狀腺B超發(fā)現(xiàn)左側(cè)甲狀腺上極內(nèi)有一占位病變，于外院行手術(shù)切除治療(具體術(shù)式不詳)，病理為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫。術(shù)前、術(shù)后血清降鈣素水平均正常，術(shù)后隨訪中血清鈣磷、CT、血MN、NMN水平均正常，iPTH水平升高，CEA陰性，甲狀旁腺及腎上腺B超未見(jiàn)異常。 對(duì)Ⅱ：3(男，50歲)、Ⅱ：4(女，50歲)、Ⅱ：7(男，45歲)、Ⅱ：9(男，43歲)、Ⅱ：10(女，43歲)

7、、Ⅱ：16(女，34歲)、Ⅲ：4(男，18歲)、Ⅲ：7(男，19歲)、Ⅲ：9(男，13歲)、Ⅲ：10(男，12歲)、Ⅲ：11(男，10歲)、Ⅲ：12(男，6歲)、Ⅲ：13(男，6歲)家庭成員進(jìn)行的血清鈣磷、CT、血MN、NMN等水平檢查均正常，而在iPTH的檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)3位家庭成員iPTH水平升高：Ⅱ：10、Ⅲ：9、Ⅲ：13；其中對(duì)Ⅲ：4、Ⅲ：11、Ⅲ：13進(jìn)行甲狀腺、甲狀旁腺和腎上腺B超檢查，均未發(fā)現(xiàn)異常。 2.家系2

8、 2.1先證者(Ⅱ：5)，男，27歲，手術(shù)并病理證實(shí)診斷為雙側(cè)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤。術(shù)后3年復(fù)查血清鈣磷、iPTH、NMN、MN水平無(wú)明顯異常，CEA陰性，血CT明顯升高，B超提示甲狀腺雙側(cè)葉內(nèi)實(shí)質(zhì)性占位病變，可見(jiàn)鈣化，尚未行手術(shù)治療。甲狀旁腺B超未見(jiàn)異常。 2.2先證者兄長(zhǎng)(Ⅱ：3)，男，36歲，經(jīng)手術(shù)病理診斷為雙側(cè)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤。血清鈣磷、血iPTH水平正常，CEA陰性，血CT水平升高。B超發(fā)現(xiàn)甲狀腺多發(fā)結(jié)節(jié)，未見(jiàn)鈣化，尚未行

9、手術(shù)治療。甲狀旁腺B超未見(jiàn)異常。 2.3家系2中其他家庭成員情況： Ⅲ：3，先證者的侄子，男，8歲，病史及查體無(wú)特殊。血鈣正常，血磷偏高，血CT、iPTH、 MN、NMN、血游離三碘甲腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、促甲狀腺激素(TSH)水平均正常，血CEA陰性；甲狀腺B超見(jiàn)兩側(cè)葉多發(fā)囊性病變；甲狀旁腺和腎上腺B超未見(jiàn)異常。 Ⅲ：4，先證者的兒子，男，1歲，病史及查體無(wú)特殊。血鈣磷、iPTH、MN、N

10、MN水平均正常，CEA陰性，血CT水平升高；甲狀腺、甲狀旁腺及腎上腺B超未見(jiàn)異常。 二．實(shí)驗(yàn)方法： 1.PCR擴(kuò)增：用鹽析法提取研究對(duì)象的外周血淋巴細(xì)胞基因組DNA。對(duì)兩個(gè)家系的先證者PCR擴(kuò)增出RET原癌基因中發(fā)生突變率較高的第8、10、11、13、14、15和16這7個(gè)外顯子的基因片段進(jìn)行測(cè)序(相關(guān)引物均由上海瑞金醫(yī)院內(nèi)分泌研究所饋贈(zèng))(見(jiàn)表1)，PCR反應(yīng)體系為20μL(見(jiàn)表3)。再根據(jù)先證者發(fā)生突變的位點(diǎn)，對(duì)其家

11、庭成員進(jìn)行相應(yīng)外顯子測(cè)序。為排除合并其他位點(diǎn)的基因突變，對(duì)家系1中的先證者DNA的其余的14個(gè)外顯子(第1、2、3、4、5、6、7、9、12、17、18、19、20、21)也進(jìn)行了擴(kuò)增測(cè)序。 2.DNA測(cè)序分析：PCR產(chǎn)物根據(jù)Sanger雙脫氧鏈終止法原理，用PE公司ABIPRISMTM377熒光自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。 3.亞克隆測(cè)序：家系1中的先證者及其姐姐的PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后發(fā)現(xiàn)第11外顯子存在新的突變方式，為了進(jìn)一步明確

12、突變位點(diǎn)進(jìn)行亞克隆測(cè)序。 4.生化指標(biāo)測(cè)定：相關(guān)血生化指標(biāo)由本院內(nèi)分泌科實(shí)驗(yàn)室及生化實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果: 1.在家系1的先證者(臨床診斷為MEN2A，雙側(cè)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤和甲狀腺髓樣癌)，其一姐(臨床診斷為MEN2A，雙側(cè)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤)，其一弟(臨床診斷為MEN2A，甲狀腺髓樣癌)及另外2例未發(fā)病的家庭成員(Ⅱ：17、Ⅲ：10)中，發(fā)現(xiàn)了RET原癌基因第11外顯子存在相同的雜合突變1893-1895del

13、CGA(見(jiàn)圖3-10)，是一種新的突變類(lèi)型。其他進(jìn)行DNA測(cè)序的家庭成員未見(jiàn)以上突變。 2.在家系2的先證者(臨床診斷為雙側(cè)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤)，其兄長(zhǎng)(臨床診斷為雙側(cè)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤)及先證者尚未發(fā)病的兒子3個(gè)家庭成員中，發(fā)現(xiàn)了RET原癌基因第11外顯子存在相同的雜合突變Cys634Arg(見(jiàn)圖11-14)，是文獻(xiàn)報(bào)道中發(fā)生率較高的一種突變類(lèi)型之一。 3.家系1和家系2的RET原痛基因的突變方式不同，但臨床表現(xiàn)相似。發(fā)病

14、成員均為中年發(fā)病，大部分以雙側(cè)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤起病；有不同程度的甲狀腺異常，或血CT升高伴或不伴甲狀腺出現(xiàn)占位性病變，或已確診為MTC；盡管發(fā)現(xiàn)部分成員血iPTH升高，但尚缺少診斷HPT的其他證據(jù)。 結(jié)論: 1.RET原癌基因第11外顯子1893-1895delCGA雜合突變及Cys634Arg雜合突變，均為MEN2A的致病基因，而前者是一種未見(jiàn)報(bào)道的新的突變類(lèi)型。 2.雖然本研究中2個(gè)MEN2A家系的RET原癌