miR-590-5p通過抑制PDCD4的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖.pdf

1、研究背景:肝細(xì)胞癌(HCC)，簡(jiǎn)稱肝癌，是目前發(fā)病率、死亡率較高的惡性腫瘤之一。在我國(guó)，肝癌是最常見及預(yù)后最差的惡性腫瘤，死亡率約為20.4/10萬，占我國(guó)全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的18.8％，居第二位。所以對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制、預(yù)后診斷等內(nèi)容的研究，一直是腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)。經(jīng)過多年來對(duì)肝癌的臨床研究，盡管已在肝癌的發(fā)病機(jī)理、分子診斷、預(yù)后評(píng)估等方面取得較大進(jìn)展，但肝癌五年生存率仍相對(duì)較低。故從研究肝癌相關(guān)基因著手，完善對(duì)肝癌發(fā)病機(jī)制的系統(tǒng)認(rèn)

2、識(shí)，對(duì)闡明肝癌的發(fā)病機(jī)理以及開發(fā)出新的診斷、治療手段，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 小分子RNA(miRNA)是由21-25個(gè)非編碼核苷酸組成的微小RNA分子，通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)部分或完全匹配來抑制靶基因的翻譯或降解靶基因的mRNA。通過調(diào)控癌基因或抑癌基因的表達(dá)，microRNA可以介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。研究人員在腫瘤之中發(fā)現(xiàn)越來越多基因與表觀遺傳均伴有microRNA的改變，功能學(xué)實(shí)驗(yàn)闡明了這些m

3、icroRNAs在腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展中起著促進(jìn)或抑制的作用。microRNAs介導(dǎo)調(diào)控腫瘤的發(fā)生與發(fā)展的途徑可能有以下幾種:與抑癌基因結(jié)合的microRNAs過表達(dá)或信號(hào)放大，與癌基因結(jié)合的microRNAs內(nèi)源性丟失。已發(fā)現(xiàn)多種miRNA與癌癥有著密切的關(guān)系，最近研究人員發(fā)現(xiàn)miR-590-5p（miR-590）在肝癌中高表達(dá)，并通過下調(diào)TGF-β RⅡ抑制TGF-β/SMAD信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控肝癌發(fā)生發(fā)展。但TGF-β/SMAD信號(hào)通路

4、在癌癥發(fā)展的不同時(shí)期所起的作用完全相反，在癌癥初期TGF-β/SMAD信號(hào)通路抑制癌癥的發(fā)生發(fā)展，而當(dāng)癌癥發(fā)展到一定階段TGF-β/SMAD信號(hào)通路又會(huì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。這樣就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)問題，在肝癌前期miR-590表達(dá)上調(diào)抑制了TGFβ/SMAD信號(hào)通路導(dǎo)致肝癌發(fā)生發(fā)展，但在肝癌后期miR-590抑制TGF-β/SMAD信號(hào)通路，對(duì)肝癌進(jìn)展會(huì)不會(huì)有抑制作用呢？因此，肝癌后期miR-590對(duì)TGF-β/SMAD信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制不清。研究發(fā)

5、現(xiàn)，miR-590其中一個(gè)靶基因——程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)是一個(gè)重要的腫瘤抑制因子。人PDCD4基因定位于10q24，cDNA編碼區(qū)約1.4kb，編碼的蛋白約含469個(gè)氨基酸。大量的研究發(fā)現(xiàn)PDCD4基因是一種抑癌基因，通過影響癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移或抗凋亡能力發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)。我們知道細(xì)胞異常增殖是癌癥的一個(gè)主要特征，那由肝細(xì)胞異常增殖導(dǎo)致的肝癌，是否與miR-590及其靶基因PDCD4有關(guān)，兩者是如何對(duì)肝細(xì)胞增殖發(fā)揮調(diào)控作用

6、的，國(guó)內(nèi)暫未見相關(guān)報(bào)道。
　　 研究目的:通過檢測(cè)對(duì)比人正常肝細(xì)胞株L-02和肝癌細(xì)胞株、肝癌組織和癌旁組織中miR-590的表達(dá)情況，探討miR-590在肝癌的發(fā)生發(fā)展中是否起著重要作用;結(jié)合術(shù)后隨訪結(jié)果分析miR-590是否影響肝癌患者的預(yù)后。采用MTT實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、Western Blot、熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)及生物信息學(xué)等方法，從細(xì)胞水平及分子水平探討miR-590如何調(diào)控肝癌的發(fā)生發(fā)展，闡明miR-

7、590、PDCD4在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控作用，為肝癌診斷、治療新手段的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。
　　 研究方法:1.檢測(cè)miR-590在肝癌中的表達(dá)情況。主要采用Real-time PCR為檢測(cè)手段，分析對(duì)比不同樣品中miR-590的表達(dá)差異。(1)以12例新鮮肝癌和癌旁組織為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分析不同分期的肝癌組織中miR-590的表達(dá)情況，觀察miR-590是否與肝癌的惡性程度相關(guān);(2)在64例液氮凍存肝癌組織（南方醫(yī)

8、院）中檢測(cè)miR-590的表達(dá)水平，按表達(dá)量高低分為miR-590高表達(dá)組和miR-590低表達(dá)組，結(jié)合患者隨訪資料進(jìn)行生存分析，了解miR-590與病人預(yù)后的相關(guān)性;(3)觀察miR-590在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中的表達(dá)差異。
　　 2.miR-590的生物學(xué)功能研究。以miR-590低表達(dá)和miR-590高表達(dá)的肝癌細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，分別在兩株肝癌細(xì)胞株上高表達(dá)miR-590和抑制miR-590表達(dá)，檢測(cè)肝細(xì)胞的增殖與miR

9、-590的表達(dá)量相關(guān)性。(1)利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同方法處理后肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、存活情況;(2)利用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同方法處理后肝癌細(xì)胞的增殖能力變化;(3)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同方法處理后肝癌細(xì)胞在增殖時(shí)發(fā)生的細(xì)胞周期變化。
　　 3.研究miR-590是否直接結(jié)合PDCD4的3'UTR而抑制其蛋白翻譯。(1)生物信息學(xué)分析miR-590靶基因的結(jié)合位點(diǎn)，篩選出候選靶基因PDCD4;(2)在miR-590的高、低表達(dá)組中分

10、別選擇MHCC97H、MHCC97L為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別轉(zhuǎn)染miR-590-inhibitor及miR-590，采用Western blot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后PDCD4蛋白表達(dá)量的變化，檢驗(yàn)PDCD4的表達(dá)是否受miR-590的表達(dá)變化影響;(3)采用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，更進(jìn)一步地探討miR-590是否直接與PDCD4的3'UTR結(jié)合抑制PDCD4的蛋白翻譯。
　　 4.PDCD4對(duì)肝癌細(xì)胞增殖功能影響的重要性研究。

11、(1)對(duì)MHCC97L分別轉(zhuǎn)染miR-590、miR-590+PDCD4及miR-590+PDCD4-3' UTR，用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，檢驗(yàn)PDCD4是否可以阻斷miR-590對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)功能，并進(jìn)一步檢驗(yàn)PDCD4是否受miR-590調(diào)控抑制;(2) Western blot技術(shù)檢測(cè)7株肝細(xì)胞（1株正常肝細(xì)胞LO-2和6株肝癌細(xì)胞）中PDCD4的表達(dá)水平，結(jié)合之前檢測(cè)各株肝細(xì)胞中miR-590的表達(dá)，分析肝癌細(xì)胞中

12、miR-590的表達(dá)與PDCD4的表相關(guān)性。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.miR-590在肝癌中高表達(dá)并對(duì)患者預(yù)后帶來不良影響。(1)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)12對(duì)肝癌組織和癌旁組織的樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-590在肝癌組織中高表達(dá);(2)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)64例帶有術(shù)后隨訪資料的冰凍肝癌組織樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-590高表達(dá)預(yù)示較差的預(yù)后和更高的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)(p＜0.01);(3)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)比正常肝細(xì)胞株和肝

13、癌細(xì)胞株中miR-590的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-590在肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)(p＜0.05)。
　　 2.miR-590影響肝癌的增殖。(1)用MTT法檢測(cè)6株肝癌細(xì)胞系HepG2、MHCC97L、BEL-7402、MHCC97H、Huh7和Hep3B及一株正常肝細(xì)胞系LO-2的生長(zhǎng)、存活情況，分析miR-590的表達(dá)與肝細(xì)胞存活的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-590的表達(dá)與肝細(xì)胞的存活率正相關(guān);(2)在6株肝癌細(xì)胞系中選擇miR-5

14、90表達(dá)量最低的MHCC97L及miR-590表達(dá)量最高的MHCC97H作為細(xì)胞模型，分別以MTT法、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)高表達(dá)miR-590對(duì)MHCC97L和下調(diào)miR-590表達(dá)對(duì)MHCC97H的增殖影響，流式細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)高表達(dá)miR-590和下調(diào)miR-590表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞周期的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-590可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，下調(diào)miR-590的表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞增殖。
　　 3.miR-590直接調(diào)控PD

15、CD4的翻譯表達(dá)。(1)從Target Scan和PicTar對(duì)miR-590的target基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，顯示miR-590可以強(qiáng)結(jié)合PDCD4的3'UTR;(2)使用Western Blot的方法檢驗(yàn)MHCC97L-NC、MHCC97L-miR-590、MHCC97H-NC和MHCC97H-miR-590-in中PDCD4蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-590與肝癌細(xì)胞中PDCD4蛋白的表達(dá)負(fù)相關(guān);(3)熒光素酶報(bào)告結(jié)果:轉(zhuǎn)染miR-59

16、0 mimic后熒光素酶的表達(dá)被抑制并存在劑量效應(yīng);而當(dāng)miR-590的表達(dá)被抑制后，熒光素酶的表達(dá)增強(qiáng)(p＜0.05)，其效果與miR-590 inhibitor的劑量正相關(guān);miR-590與PDCD4的結(jié)合位點(diǎn)被突變后，熒光素酶的表達(dá)和對(duì)照組沒明顯區(qū)別。
　　 4.PDCD4在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。(1)克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PDCD4基因的過表達(dá)可以抑制miR-590高表達(dá)在肝癌中促進(jìn)增殖的生物學(xué)功能;(2)結(jié)合熒光

17、定量PCR和Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞中PDCD4與miR-590的表達(dá)負(fù)相關(guān)（r=-0.617，p＜0.05)。
　　 結(jié)論:miR-590在肝癌中高表達(dá)并且與肝癌惡性程度正相關(guān)，與患者生存時(shí)間負(fù)相關(guān);miR-590的表達(dá)和肝癌細(xì)胞的增殖能力正相關(guān);miR-590通過和PDCD4 mRNA的3'UTR結(jié)合抑制其翻譯表達(dá);高表達(dá)PDCD4可以抑制miR-590在肝細(xì)胞中促增殖的能力;PDCD4和miR-590在肝細(xì)胞