耐藥革蘭陽性球菌感染病原基因診斷研究.pdf

1、該課題在分析臨床常見病原菌共有的23S rRNA基因以及革蘭陽性球菌主要耐藥基因的基礎上,建立了可用于檢測耐藥革蘭陽性球菌的快速基因診斷方法,有望為臨床重癥感染的早期病原診斷和及時正確的抗感染提供客觀依據(jù).第一部分:臨床常見病原菌分子生物學鑒定方法研究.核糖體核糖核酸(ribosomal RNA,rRNA)基因為所有生物體生存所必需的基因序列并且也是較保守的序列.細菌的rRNA基因由5S、16S以及23S rRNA基因三部分構成.其中基

2、因序列均含有保守區(qū)和多變區(qū),多變區(qū)序列在不同種類細菌中各不相同,可提供區(qū)分不同細菌的重要信息,故多變區(qū)的序列可用于細菌的進一步區(qū)分和鑒定;利用基因序列保守區(qū)可設計通用引物,使同時擴增、檢測多種細菌成為可能,以往應用16S rRNA基因檢測細菌較多,近年來23S rRNA基因的應用有所增多.故該研究為明確23S rRNA基因用于臨床常見致病菌鑒定的可行性,首先利用多變區(qū)兩端保守序列設計的一對通用引物,對13種臨床常見致病菌的23S rRN

3、A基因部分序列進行了擴增及測序,序列采用DNAStar軟件進行分析.第二部分:耐藥革蘭陽性球菌主要耐藥基因檢測方法研究.耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococci,MRS)、耐萬古霉素腸球菌(vancomycin-resistant enterococci,VRE)以及青霉素不敏感肺炎鏈球菌(penicillin nonsusceptible Steptococcus pneumoniae

4、,PNSSP)是目前臨床上最重要的耐藥革蘭陽性球菌,建立快速、特異、靈敏的檢測方法對這類細菌所致感染的診治具有重要意義.這些耐藥菌的耐藥機制已基本明確,由于mecA、vanA與vanB分別是MRS與VRE的耐藥決定基因,上述基因的檢出可以確定被測細菌為相應的耐藥菌,故我們首先分析了mecA與vanA、vanB的基因序列,分別設計了mecA基因的特異性引物和vanA、vanB兩種基因的通用引物,建立了可擴增mecA與vanA/B的PCR檢

5、測方法;PNSSP的耐藥機制與上述2類耐藥有所不同,是由于編碼PBPs的基因,其中主要是PBP2b基因發(fā)生變異,它們的編碼產(chǎn)物與青霉素的親和力下降,從而導致肺炎鏈球菌對青霉素耐藥.第三部分:耐藥革蘭陽性球菌感染病原基因診斷方法的建立與應用研究.由于耐藥菌所致嚴重感染的快速診斷對疾病的診治至關重要,而常規(guī)方法因耗時較長常常難以滿足臨床救治危重病患的需要,建立靈敏、快速的檢測方法是目前亟待解決的課題,故我們在前兩部分研究的基礎上,就建立以P