非諾貝特對人淋巴瘤T細胞TLR4信號傳導(dǎo)通路相關(guān)因子表達的影響.pdf

1、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)慢性炎癥性脫髓鞘疾病;其特征性病理改變是CNS白質(zhì)內(nèi)多發(fā)性脫髓鞘斑塊。確切病因及發(fā)病機制尚不清楚,目前普遍認為MS是主要由CD4+T細胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)性疾病。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)與MS在臨床表現(xiàn)和病理過程十分相似,被認為是研究MS的發(fā)病機制和治療方法的理

2、想動物模型。
　　 Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是1991年在研究果蠅胚胎發(fā)育時發(fā)現(xiàn)的一種跨膜蛋白。1997年Janewayt等首次在人體分離出了Toll樣受體同系物,后將其命名為TLR4。目前為止,已經(jīng)已確認人類11個TLRs家族成員和鼠類13個成員,TLRs主要分布于免疫細胞如樹突狀細胞、淋巴細胞、單核巨噬細胞等,在白細胞、內(nèi)皮細胞、心肌細胞等也有不同程度的表達。TLR家族成員均屬I類跨膜蛋

3、白,由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)組成。不同的TLR可相對特異地識別不同的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)。其中,TLR4是主要的脂多糖(LPS)識別受體,同時,脂磷壁酸、纖粘連蛋白、紫杉醇等也可作為TLR4的配體。由LPS誘導(dǎo)的TLR的活化不僅可以通過激活核因子KappaB(NF-κB)而最終誘導(dǎo)免疫細胞釋放炎癥因子如TNF-α等,還可以誘導(dǎo)樹突狀細胞成熟分化以及產(chǎn)

4、生各種細胞因子激活B細胞,從而對獲得性免疫的建立起著很重要的作用。
　　 過氧化體增殖物激活型受體(Peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)是一組核激素受體,PPAR在體內(nèi)主要有3種亞型,即α,β和γ型。PPARs激動劑具有多種生物效應(yīng),改善脂代謝紊亂,增強機體胰島素敏感性,影響腫瘤生長,對心血管產(chǎn)生保護效應(yīng)。新近研究表明,活化的PPARs亦能發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護作用。目前認

5、為PPARα激動劑對自身免疫性神經(jīng)退行性疾病的神經(jīng)保護作用有以下機制參與:(1)上調(diào)保護性Th2細胞比例,發(fā)揮神經(jīng)保護作用。(2)減少Th1細胞及其細胞因子的產(chǎn)生,降低其致腦脊髓炎損傷作用。(3)通過T細胞受體抑制炎性細胞的分泌增加。(4)趨化因子MCP-1等的分泌,抑制炎癥反應(yīng)。(5)維甲酸類X受體(RXRs)與PPARpα相互作用后,形成異二聚體,上調(diào)PPAR基因表達。(6)抑制巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞分泌的NO。由此可見,PPARα激

6、動劑有望成為治療CNS疾病的新靶點。
　　 本實驗通過觀察PPARα激動劑非諾貝特對脂多糖作用下人淋巴瘤T細胞TLR4信號傳導(dǎo)通路相關(guān)因子表達的影響。從而探討PPARα激動劑非諾貝特能否通過抑制TLR4表達起到抑制炎癥擴大的作用。
　　 實驗材料與方法：
　　 1、實驗用細胞及細胞培養(yǎng)
　　 人淋巴瘤T細胞HuT102(購買于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC編號:GDC051)用含10%胎牛血清的

7、RPMI-1640培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),培養(yǎng)液中加青霉素和鏈霉素各100μg/ml,2-3天更換培養(yǎng)基并傳代一次。
　　 2、脂多糖對人淋巴瘤T細胞(HuT102)TLR4信號傳導(dǎo)通路中相關(guān)因子的影響。
　　 (1)用RT-PCR方法檢測不同濃度LPS(空白對照組、0.01μg/ml,0.1μg/ml,1μg/ml)刺激Hut102細胞后TLR4、IRAK-1、TNF-αmRNA表達。
　　

8、(2)用RT-PCR方法檢測不同時間LPS(0,2h,4h,6h)刺激Hut102細胞后TLR4、IRAK-1、TNF-αmRNA表達。
　　 (3)用ELISA方法檢測不同濃度LPS(空白對照組、0.01μg/ml,0.1μg/ml,1μg/ml)刺激Hut102細胞后TNF-α蛋白的表達。
　　 3、非諾貝特對脂多糖作用下人淋巴瘤T細胞(HUT102)TLR4信號傳導(dǎo)通路中相關(guān)因子的影響。
　　 (1)用RT

9、-PCR方法檢測不同濃度非諾貝特(0.1%DMSO、100μmol/L、50μmol/L)對脂多糖(1μg/ml)作用下HUT102細胞TLR4、IRAK-1、TNF-α mRNA表達。(2)用ELISA方法檢測不同濃度非諾貝特(0.1%DMSO、100μmol/L、50μmol/L)對脂多糖(1μg/ml)作用下HuT102細胞上清TNF-α蛋白的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1、不同濃度LPS刺激Hut102細胞后TL

10、R4、IRAK-1、TNF-αmRNA表達。
　　 與對照組相比,經(jīng)不同濃度LPS刺激4h后,上述目的基因mRNA表達均升高。以1μg/ml濃度組的上調(diào)作用最明顯(p＜0.01)。
　　 2、不同時間LPS刺激Hut102細胞后TLR4、IRAK-1、TNF-αmRNA表達。
　　 與對照組相比,經(jīng)1μg/mlLPS刺激不同時間(2、4、6h)后,上述目的基因mRNA表達均升高。以刺激6hr組的上調(diào)作用最明顯(p

11、＜0.01)。
　　 3、不同濃度LPS刺激Hut102細胞后TNF-α蛋白的表達。
　　 不加LPS刺激的對照組中TNF-α蛋白的表達量為521.47pg/ml,經(jīng)不同濃度的LPS刺激12hr后,TNF-α蛋白的表達量分別為703.87pg/ml、1028.03pg/ml、1636.08pg/ml(p＜0.01)。
　　 4、非諾貝特對LPS刺激Hut102細胞后TLR4、IRAK-1、TNF-α mRNA表達

12、的影響
　　 與0.1%DMSO對照組比較,不同濃度的非諾貝特(100μmol/L、50μmol/L)組TLR4、IRAK-1、TNF-αmRNA均下調(diào)(p＜0.01)。
　　 5、非諾貝特對LPS刺激Hut102細胞TNF-α蛋白表達的影響
　　 與0.1%DMSO對照組比較,不同濃度的非諾貝特(100μmol/L、50μmol/L)組TNF-α蛋白下調(diào)。其中,100μmol/L非諾貝特抑制率為57.14%,5