小RNA-21通過PTEN-Akt信號(hào)介導(dǎo)了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β引起的肝細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化.pdf

1、目的：
　　肝纖維化是以細(xì)胞外基質(zhì)的過多沉積為特征，細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源是激活的肝星狀細(xì)胞。研究表明上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在其中也起著重要的作用。EMT是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，其標(biāo)志為上皮標(biāo)志蛋白表達(dá)下降和間皮標(biāo)志蛋白的表達(dá)升高。小RNA(microRNA，miR)是一類長(zhǎng)度約22～28個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，其在轉(zhuǎn)錄后

2、水平和翻譯水平的基因調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，參與了許多生理病理過程的調(diào)節(jié)。我們的前期工作表明miR-21在肝星狀細(xì)胞激活過程中起著重要的作用。本研究的目的是探討miR-21在人肝細(xì)胞株(QSG-7701) EMT中的作用和機(jī)理。
　　方法：
　　1.TGF-β1對(duì)人肝細(xì)胞EMT的作用。
　　用10ng/mlTGF-β1刺激人肝細(xì)胞株QSG-7701細(xì)胞1、3、5、7天后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，western bl

3、ot檢測(cè)上皮標(biāo)志蛋白（E-鈣粘蛋白）和間皮標(biāo)志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)的表達(dá)。
　　2.TGF-β1刺激miR-21的表達(dá)。
　　用10ng/mlTGF-β1刺激人肝細(xì)胞株QSG-7701細(xì)胞1、3、5、7天后，real-timeRT-PCR檢測(cè)miR-21的表達(dá)。
　　3.MiR-21介導(dǎo)了TGF-β1對(duì)人肝細(xì)胞EMT作用。
　　轉(zhuǎn)染100nM miR-21抑制劑(miR-21 inhibitor)沉默m

4、iR-21后，TGF-β1刺激人肝細(xì)胞株QSG-77015天，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后real-time RT-PCR檢測(cè)miR-21的表達(dá)。TGF-β1刺激5天后顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。western blot檢測(cè)上皮標(biāo)志蛋白(E-鈣粘蛋白)和間皮標(biāo)志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)。
　　4.MiR-21對(duì)人肝細(xì)胞EMT的作用。
　　用100nMmiR-21模擬物(miR-21mimics)轉(zhuǎn)染人肝細(xì)胞株，24小時(shí)后用real-t

5、imeRT-PCR檢測(cè)miR-21的表達(dá)。3天后用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，用western blot檢測(cè)上皮標(biāo)志蛋白（E-鈣粘蛋白）和間皮標(biāo)志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)。
　　5.PTEN/Akt通路介導(dǎo)了人肝細(xì)胞EMT
　　(1) TGF-β1刺激細(xì)胞后，western blot檢測(cè)PTEN。
　　(2)轉(zhuǎn)染miR-21模擬物和miR-21抑制劑后，western blot檢測(cè)PTEN。
　　(3)用5μ

6、M的Akt抑制劑(Akt inhibitorⅣ)預(yù)處理后，TGF-β1刺激細(xì)胞。用western blot檢測(cè)Akt磷酸化，上皮標(biāo)志蛋白(E-鈣粘蛋白)、間皮標(biāo)志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白）的表達(dá)。
　　(4)100nMmiR-21模擬物轉(zhuǎn)染人肝細(xì)胞株QSG-7701細(xì)胞后，加入5μM的Akt抑制劑(Akt inhibitorⅣ)，western blot檢測(cè)Akt磷酸化，上皮標(biāo)志蛋白(E-鈣粘蛋白)、間皮標(biāo)志蛋白(N-鈣粘蛋白

7、、波形蛋白)的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.TGF-β1刺激引起了人肝細(xì)胞的EMT
　　(1) TGF-β1刺激引起了肝細(xì)胞形態(tài)改變，由原先多邊形的緊密排列的上皮樣細(xì)胞，變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)紡錘樣有較多觸角的成纖維細(xì)胞狀樣細(xì)胞。
　　(2) TGF-β1刺激引起了上皮標(biāo)志蛋白(E-鈣粘蛋白)表達(dá)下降。
　　(3) TGF-β1刺激引起了間質(zhì)標(biāo)志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)表達(dá)上升。
　　2.TGF-β1刺激人肝細(xì)

8、胞miR-21的表達(dá):在TGF-β1刺激5天后miR-21的表達(dá)明顯上升。
　　3.MiR-21介導(dǎo)了TGF-β1的EMT作用。
　　(1)轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑24小時(shí)后，miR-21的表達(dá)明顯下降。
　　(2)形態(tài)改變:miR-21抑制劑組較對(duì)照組性狀更圓鈍，觸角更少，排列更緊密。
　　(3)上皮標(biāo)志蛋白(E-鈣粘蛋白)較對(duì)照組表達(dá)升高。
　　(4)間質(zhì)標(biāo)志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)表達(dá)較對(duì)照組表達(dá)

9、下降。
　　以上結(jié)果提示下調(diào)miR-21表達(dá)后，阻斷了TGF-β1致肝細(xì)胞EMT作用。4.miR-21轉(zhuǎn)染直接刺激人肝細(xì)胞的EMT
　　(1)轉(zhuǎn)染miR-21模擬物24小時(shí)后，miR-21的表達(dá)明顯增高。
　　(2) miR-21模擬物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞形態(tài)較對(duì)照組變瘦長(zhǎng)，觸角更多，排列更松散。
　　(3) miR-21模擬物轉(zhuǎn)染組上皮標(biāo)志蛋白(E-鈣粘蛋白)較對(duì)照組表達(dá)下降。
　　(4) miR-21模擬物轉(zhuǎn)染組

10、間質(zhì)標(biāo)志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)表達(dá)較對(duì)照組下降。
　　以上結(jié)果提示miR-21過表達(dá)可直接刺激人肝細(xì)胞的EMT
　　5.PTEN/Akt通路介導(dǎo)了人肝細(xì)胞的EMT作用
　　(1) TGF-β1調(diào)節(jié)了PTEN蛋白的表達(dá):TGF-β1刺激細(xì)胞后PTEN表達(dá)下降。
　　(2) miR-21調(diào)節(jié)了PTEN蛋白的表達(dá):轉(zhuǎn)染miR-21模擬物后PTEN表達(dá)下降，轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后PTEN表達(dá)上升。
　　(

11、3)抑制Akt減少了TGF-β1的EMT作用:Akt抑制劑+TGF-β1組較TGF-β1組上皮標(biāo)志蛋白(E-鈣粘蛋白)表達(dá)升高。間質(zhì)標(biāo)志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)表達(dá)下降。
　　(4)抑制Akt減少了miR-21的EMT作用:Akt抑制劑+miR-21模擬物組較miR-21模擬物組上皮標(biāo)志蛋白（E-鈣粘蛋白）表達(dá)升高，間質(zhì)標(biāo)志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)表達(dá)下降。
　　結(jié)論：
　　MiR-21通過PTEN/Akt