小鼠缺血再灌注腦損傷中Wnt-β-catenin信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá)及其與海馬神經(jīng)發(fā)生的影響.pdf

1、目的：初步探討 Wnt/β-catenin相關(guān)因子在缺血再灌注（ischemia-reperfusion injury，IRI）小鼠海馬中的表達(dá)規(guī)律及其對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖作用。
　　方法：
　　1、將160只1月齡健康雄性昆明小鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、缺血再灌注后1d、3d、7d、14d、21d、28d組，通過(guò)夾閉小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈半小時(shí)再通的方法建立小鼠腦缺血再灌注損傷模型。分別對(duì)模型小鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)、四肢協(xié)調(diào)性檢查，

2、同時(shí)運(yùn)用 Y-型電迷宮檢測(cè)小鼠腦缺血再灌注后記憶能力，并采用 TTC染色觀察腦缺血再灌注后小鼠腦梗死情況；尼氏染色和透射電鏡觀察海馬區(qū)的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化；采用原位雜交法和免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路重要信號(hào)分子Wnt1、Wnt3a、β-catenin、cyclinD1、GSK3β的表達(dá)變化。
　　2、將260只小鼠隨機(jī)分為正常組，IRI后1d、3d、7d、14d、21d、28d+海馬內(nèi)注射生理鹽水組；缺血

3、再灌注后1d、3d、7d、14d、21d、28d+海馬內(nèi)注射pβ-catenin組，每組20只。海馬內(nèi)注射pβ-catenin組在模型建立后24h腦內(nèi)注射pβ-cateninS33Y質(zhì)粒。采用腹腔注射BrdU方法檢測(cè)海馬齒狀回區(qū)NSCs增殖規(guī)律及通過(guò)Western-Blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)β-catenin、CyclinD1、GSK3β蛋白的表達(dá)水平；免疫組織化學(xué)染色觀察各時(shí)間點(diǎn)β-catenin、CyclinD1、GSK3β的表達(dá)變化。

4、
　　結(jié)果：
　　1、小鼠腦缺血再灌注損傷后與正常組、假手術(shù)組比較，在神經(jīng)行為學(xué)、協(xié)調(diào)性及學(xué)習(xí)記憶能力等方面均有明顯的缺失和障礙（P＜0.05），但隨著時(shí)間延長(zhǎng)其有一定恢復(fù)。
　　2、形態(tài)學(xué)檢測(cè)：①TTC染色顯示正常組和假手術(shù)組腦組織無(wú)明顯梗死灶，IRI組腦組織中梗死灶明顯。②尼氏染色顯示：IRI組隨著灌注時(shí)間的增加，神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，核固縮，核溶解，顆粒細(xì)胞呈空泡樣變性，尼氏小體溶解、消失，以21天組最為嚴(yán)重。③透射

5、電鏡顯示IRI后7d組細(xì)胞內(nèi)水腫，線粒體腫脹（空泡化，嵴斷裂），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體擴(kuò)張，核固縮，核膜間隙擴(kuò)大。
　　3、免疫組織化學(xué)檢測(cè)：結(jié)果表明正常腦組織中β-catenin、cyclinD1表達(dá)均為陰性或弱陽(yáng)性,GSK3β表達(dá)為陽(yáng)性。IRI各組中β-catenin、cyclinD1陽(yáng)性表達(dá)均顯著高于正常組和假手術(shù)組，7~14d陽(yáng)性達(dá)高峰（P＜0.05）。IRI各組中GSK3β陽(yáng)性細(xì)胞至缺血再灌注后21d表達(dá)升高（P＜0.05）。

6、IRI+NS各組β-catenin、CyclinD1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于正常組（P＜0.05），轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組β-catenin、CyclinD1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均多于未轉(zhuǎn)染組（P＜0.05），β-catenin以轉(zhuǎn)染后7d組最為顯著，CyclinD1在轉(zhuǎn)染后14d組最為顯著。IRI+NS組中GSK-3β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均低于正常組（P<0.01），轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組均低于未轉(zhuǎn)染組（P＜0.05），以轉(zhuǎn)染后14d組最為顯著。
　　4、wnt1、wnt3a原

7、位雜交檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組和假手術(shù)組比較，缺血再灌注各組均可見(jiàn) wnt1、wnt3a陽(yáng)性細(xì)胞，再灌注后1d表達(dá)開(kāi)始增加，14d達(dá)高峰，28d減少至正常水平（P<0.05）。
　　5、BrdU檢測(cè)顯示與正常組比較，缺血再灌注后3d BrdU陽(yáng)性細(xì)胞開(kāi)始增高，7d達(dá)高峰（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均多于未轉(zhuǎn)染組，以轉(zhuǎn)染后7d組最為顯著（P＜0.05）。6、Western-Blot結(jié)果表明，正常組可見(jiàn)GSK-3β蛋白

8、高表達(dá)，β-catenin蛋白、CyclinD1蛋白低表達(dá)，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組β-catenin蛋白、CyclinD1蛋白表達(dá)升高，于轉(zhuǎn)染后7-14d表達(dá)量最高。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組與正常組相比β-catenin蛋白、CyclinD1蛋白表達(dá)均明顯升高（P＜0.05）；而轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組中GSK-3β蛋白表達(dá)卻均低于正常組（P<0.01），并隨轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，轉(zhuǎn)染14d降至最低。
　　結(jié)論：
　　1.夾閉小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈的方法成功建立腦缺

9、血再灌注損傷的動(dòng)物模型。
　　2.當(dāng)Wnt/β-catenin途徑被激活時(shí)，wnt1、wnt3a有表達(dá)。
　　3.小鼠腦缺血再灌注損傷可激活Wnt信號(hào)通路，從而降低GSK3β的表達(dá)，促進(jìn)β-catenin、cyclinD1在海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層的表達(dá)。4.Wnt信號(hào)通路可能參與腦缺血再灌注損傷的發(fā)生。
　　5.小鼠海馬區(qū)注射、以脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法可成功進(jìn)行小鼠腦內(nèi)目的基因轉(zhuǎn)染。
　　6.小鼠腦缺血再灌注損傷可激發(fā)內(nèi)