柑桔衰退病RNAi-PTGS載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化酸橙研究.pdf

1、西南大學(xué)碩士學(xué)位論文柑桔衰退病RNAiPTGS載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化酸橙研究姓名：閆虎斌申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：果樹學(xué)指導(dǎo)教師：陸智明鐘廣炎20080601兩南人學(xué)壩I：學(xué)位論文(3)通過酶切連接將分別位丁質(zhì)粒pTZ57Rhp23、pTz57Rhp25、pTZ57Rhp20反向重復(fù)cDNA片段引入雙元質(zhì)粒載體pcAMBIA2301G中，替換掉載體上的GuS基因，經(jīng)酶切檢測確認(rèn)，得到了含有反向重復(fù)序列的植物表達(dá)載體pCAMBIA2301ctvh

2、p25與pCAMBIA2301ctVhp20。但是，測序發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增的p23基因片段中存在目的基因與雙元質(zhì)粒相連時(shí)所選用的酶切位點(diǎn)，因此原先構(gòu)建好的p23片段的反向重復(fù)cDNA被切開，導(dǎo)致無法獲得該序列的植物表達(dá)載體。將含有p20，p25反向重復(fù)序列的雙元質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌EHAl05中，獲得含有質(zhì)粒pcAMB認(rèn)2301cMlp25的農(nóng)桿菌EHAl05c“hp25及含有質(zhì)粒pCAMBIA230lct、，hp20的農(nóng)桿菌EHAl05ctvhp2

3、0。(4)將試管培養(yǎng)的意大利酸橙實(shí)生苗上胚軸切割成約1cm長的莖段，用農(nóng)桿菌EHAl05_ctvhp25及農(nóng)桿菌EHAl05cMlp20對(duì)其分別侵染，莖段經(jīng)過三天共培養(yǎng)及約三個(gè)月的選擇培養(yǎng)，獲得了一些可用于溫室嫁接的卡那霉素抗性芽(著有35片葉子)。目前，已有部分抗性芽被接到了枳殼砧木上，正在溫室中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因植株中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和CTv沉默效果有待進(jìn)一步檢驗(yàn)。關(guān)鍵詞：柑桔衰退病毒轉(zhuǎn)錄后的基因沉默反向重復(fù)cDNARNA沉默抑制因子植物