豬抗菌肽PR39抗細(xì)菌感染和保護(hù)腸道屏障功能的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、本研究從抗菌肽PR39調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道黏膜上皮屏障功能的角度出發(fā)，開展了三個(gè)試驗(yàn)。
　　試驗(yàn)一 抗首肽PR39在體內(nèi)的抗菌活性、穩(wěn)定性及分布研究
　　為了探明抗菌肽PR39在體內(nèi)是否具有抗菌活性，首先利用人工胃液、小腸液和血清模擬體內(nèi)環(huán)境，研究了其在體內(nèi)的抗菌活性和穩(wěn)定性?？咕钚越Y(jié)果表明，在MH肉湯培養(yǎng)基中抗菌活性較強(qiáng)的PR39，在人工胃液和小腸液環(huán)境下其抗菌活性完全喪失，而在血清中保留了一部分抗菌活性。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，P

2、R39與人工小腸液共同孵育5min即被快速降解為小肽，與人工胃液共同孵育1h內(nèi)也逐漸被降解完全，提示PR39在胃腸道環(huán)境下穩(wěn)定性極差，不宜直接口服。而PR39與血清共同孵育1h后，依然可檢測(cè)到約70％完整的PR39，其半衰期約為2h，提示PR39在血清里具有較好的穩(wěn)定性，宜通過(guò)注射給藥。進(jìn)一步通過(guò)小鼠活體成像技術(shù)，觀察抗菌肽PR39經(jīng)腹腔注射后在體內(nèi)的分布代謝情況，結(jié)果表明，PR39經(jīng)腹腔注射后可迅速被腹膜吸收而進(jìn)入機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)，30

3、min內(nèi)遍布全身，并在24h內(nèi)完全代謝出體外，提示抗菌肽PR39經(jīng)腹腔注射途徑可以進(jìn)入機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)而發(fā)揮作用。
　　試驗(yàn)二 抗菌肽PR39對(duì)小鼠抗細(xì)菌感染的作用研究
　　(1)抗首肽PR39對(duì)小鼠抗鼠傷寒沙門氏菌感染的作用研究
　　通過(guò)建立鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠模型，從表觀癥狀、炎癥反應(yīng)及腸道黏膜上皮屏障功能三個(gè)方面研究了PR39對(duì)小鼠抗沙門氏菌感染的作用:抗菌肽PR39對(duì)沙門氏首感染小鼠表觀癥狀影響的結(jié)果表明，小鼠在

4、感染鼠傷寒沙門氏菌后，出現(xiàn)食欲下降、體重下降及軟便等癥狀，而腹腔注射PR39可以明顯緩解上述癥狀，且小鼠腎臟和肝臟中細(xì)菌移位數(shù)量也顯著降低，說(shuō)明腹腔注射PR39顯著緩解了小鼠的沙門氏菌感染癥狀;抗菌肽PR39對(duì)沙門氏菌感染小鼠炎癥反應(yīng)影響的結(jié)果表明，腹腔注射PR39的沙門氏菌感染小鼠其結(jié)腸組織的MPO濃度顯著低于沙門氏菌組(P＜0.05)，但仍高于正常對(duì)照組（P＜0.05），表明PR39在一定程度上減少了沙門氏菌感染引起的小鼠結(jié)腸嗜中性

5、粒細(xì)胞浸潤(rùn)。但血清里炎性細(xì)胞因子含量及結(jié)腸中炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)水平結(jié)果顯示，沙門氏菌組小鼠和腹腔注射PR39的沙門氏菌感染小鼠的促炎因子TNF-α、IL-8和抑炎因子IL-10的表達(dá)水平并無(wú)顯著差異，均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05），提示PR39對(duì)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)與分泌并無(wú)顯著影響;抗酋肽PR39對(duì)沙門氏菌感染小鼠腸道黏膜上皮屏障功能影響的結(jié)果表明，PR39顯著緩解了沙門氏菌感染造成的小鼠回腸絨毛高度變短、隱窩加深及絨毛/隱窩比

6、下降，同時(shí)也顯著改善了結(jié)腸形態(tài)。利用尤斯灌流室測(cè)定結(jié)腸跨上皮電阻值(TER)和測(cè)定灌胃后血清中FITC-dextran含量?jī)煞N方法來(lái)評(píng)價(jià)各組小鼠的腸道通透性，結(jié)果表明，腹腔注射PR39可以顯著緩解沙門氏菌引起的小鼠腸道通透性升高，且單獨(dú)添加PR39可能增強(qiáng)了小鼠的腸道屏障功能。
　　(2)抗苗肽PR39對(duì)小鼠抗腸出血性大腸桿菌感染的作用研究
　　本試驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)建立與鼠傷寒沙門氏菌作用機(jī)制完全不同的腸出血性大腸桿菌感染的小鼠

7、模型，從表觀癥狀、腎臟及腸道組織形態(tài)和腸道黏膜上皮屏障功能三個(gè)方面研究了抗菌肽PR39對(duì)小鼠抗大腸桿菌感染的作用:抗曹肽PR39對(duì)大腸桿菌感染小鼠表觀癥狀影響的結(jié)果表明，小鼠在感染腸出血性大腸桿菌后，體重顯著下降，結(jié)腸組織MPO含量急劇升高，而腹腔注射PR39顯著緩解了上述癥狀，腎臟和肝臟中移位的細(xì)菌數(shù)量及概率也明顯降低;抗菌肽PR39對(duì)大腸桿菌感染小鼠腎臟及腸道組織形態(tài)影響的結(jié)果表明，PR39顯著緩解了腸出血性大腸桿菌感染導(dǎo)致的小鼠腎

8、臟腎間質(zhì)血管和腎小球毛細(xì)血管充血、擴(kuò)張等腎臟損傷，并且對(duì)小鼠回腸絨毛受損、黏膜下層充血，及結(jié)腸固有層水腫等形態(tài)破壞具有一定的改善作用。透射電鏡結(jié)果顯示，大腸桿菌感染后小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞遭到大腸桿菌的粘附與破壞，其微絨毛明顯扭曲、變短和斷裂，上皮細(xì)胞間緊密連接打開，而腹腔注射PR39的大腸桿菌感染小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞微絨毛排列整齊，形態(tài)正常，上皮細(xì)胞間緊密連接清晰。上述結(jié)果顯示PR39對(duì)大腸桿菌感染導(dǎo)致的腎臟及腸道組織形態(tài)受損具有一定的保護(hù)作用

9、;抗菌肽PR39對(duì)大腸桿菌感染小鼠腸道黏膜上皮屏障功能影響的結(jié)果表明，相比于大腸桿菌組，腹腔注射PR39后小鼠結(jié)腸TER值顯著升高(P＜0.05)，血清中FITC-dextran含量顯著降低(P＜0.05)，表明腹腔注射PR39可以顯著緩解腸出血性大腸桿菌引起的腸道通透性升高。此外，PR39顯著緩解了大腸桿菌感染引起的小鼠結(jié)腸ZO-1和Occludin的基因表達(dá)水平下降，且PR39單獨(dú)處理組小鼠結(jié)腸Occludin的基因表達(dá)水平顯著高于

10、正常對(duì)照組(P＜0.05)。各處理組之間ZO-2和Claudin-1的基因表達(dá)水平差異不明顯。
　　試驗(yàn)三 抗菌肽PR39調(diào)控腸道屏障功能的作用機(jī)制研究
　　(1)抗首肽PR39對(duì)細(xì)菌感染豬腸道上皮細(xì)胞屏障功能的影響
　　在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用體外豬腸道上皮細(xì)胞(IPEC-1)細(xì)菌感染模型研究PR39對(duì)細(xì)菌感染后上皮細(xì)胞的緊密連接蛋白Occludin和細(xì)胞骨架蛋白F-actin的表達(dá)與分布、粘附與入侵細(xì)胞的細(xì)菌

11、數(shù)量及上皮細(xì)胞通透性的影響。首先，不同濃度PR39作用于IPEC-1細(xì)胞后細(xì)胞的增值率和LDH釋放率的結(jié)果表明，PR39對(duì)IPEC-1細(xì)胞的毒性較小。免疫熒光試驗(yàn)觀察各組上皮細(xì)胞的Occludin和F-actin的表達(dá)與分布結(jié)果表明，沙門氏菌或大腸桿菌分別刺激IPEC-1細(xì)胞4h后，細(xì)胞Occludin熒光值減弱并從細(xì)胞膜往細(xì)胞質(zhì)分布，F(xiàn)-actin排列紊亂，出現(xiàn)應(yīng)力纖維，而2μg/mL PR39預(yù)處理明顯改善了沙門氏菌和大腸桿菌感染引

12、起的豬腸道上皮細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin的表達(dá)下降和分布異常以及細(xì)胞骨架的重排。利用Transwell培養(yǎng)IPEC-1細(xì)胞細(xì)菌感染模型研究PR39對(duì)細(xì)菌粘附與入侵，以及細(xì)胞通透性的影響發(fā)現(xiàn)，兩種試驗(yàn)設(shè)計(jì)（2μg/mL PR39預(yù)處理IPEC-1細(xì)胞后不洗去直接進(jìn)行細(xì)菌感染，或洗去后再進(jìn)行細(xì)菌感染）均能顯著減少沙門氏菌的入侵?jǐn)?shù)和大腸桿菌的粘附數(shù)(P＜0.05)，且體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示PR39濃度為2μg/mL時(shí)對(duì)沙門氏菌和大腸桿菌都

13、沒有抗菌活性。測(cè)定各組細(xì)胞TER值發(fā)現(xiàn)，PR39能顯著緩解細(xì)菌感染導(dǎo)致的IPEC-1細(xì)胞通透性升高(P＜0.05)。以上結(jié)果提示抗菌肽PR39可能通過(guò)增強(qiáng)腸道上皮細(xì)胞屏障功能發(fā)揮了抗細(xì)菌粘附與入侵的作用，而不是通過(guò)其抗菌作用實(shí)現(xiàn)的。
　　(2)單獨(dú)添加抗菌肽PR39對(duì)豬腸道上皮細(xì)胞屏障功能的影響
　　利用研究緊密連接蛋白組裝的經(jīng)典方法Calcium Switch，進(jìn)一步研究單獨(dú)添加PR39對(duì)上皮細(xì)胞通透性及緊密連接蛋白Occ

14、ludin表達(dá)的影響。結(jié)果表明，在細(xì)胞培養(yǎng)基中缺鈣再恢復(fù)鈣離子后，2μg/mL及以上濃度PR39處理組的TER值恢復(fù)速度顯著快于對(duì)照組，而且0.5μg/mL以上濃度處理組均能提高IPEC-1細(xì)胞Occludin蛋白的表達(dá)。上述結(jié)果表明抗菌肽PR39可促進(jìn)緊密連接蛋白Occludin的表達(dá)，調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞的通透性。
　　(3)基因芯片分析抗菌肽PR39對(duì)豬腸道上皮細(xì)胞基因表達(dá)的影響
　　利用基因芯片技術(shù)篩選PR39處理后豬腸

15、道上皮細(xì)胞IPCE-1的差異表達(dá)基因，結(jié)果表明，基因表達(dá)差異達(dá)2倍以上的基因共有138個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的基因有134個(gè)，下調(diào)的基因?yàn)?個(gè)。通過(guò)MAS3.0分析得出這些差異表達(dá)基因涉及的通路包括Tight junction、Regulation of actin cytoskeleton和Pathogenic Escherichia coli infection-EHEC等與本研究密切相關(guān)的信號(hào)通路，這些通路多涉及Rho小G蛋白家族(Rh

16、o GTPase)、WASL、PRKAA1及MAP3K5等基因，其中與Rho GTPase家族成員相關(guān)的通路最多。
　　(4)抗菌肽PR39調(diào)控豬腸道上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的分子機(jī)制研究
　　由于基因芯片結(jié)果的啟發(fā)，從Rho GTPase家族入手，進(jìn)一步研究PR39調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞屏障功能的分子機(jī)制。G-LISA法測(cè)定細(xì)胞中RhoA，Rac1和Cdc42的活化水平試驗(yàn)結(jié)果表明，抗菌肽PR39處理細(xì)胞5 min和24 h后，IP

17、EC-1細(xì)胞Rac1的活化量較正常對(duì)照組顯著升高(P＜0.05)，而RhoA與Cdc42均無(wú)顯著變化。利用Rac1的專一抑制劑NSC23766研究抑制Rac1的活化后對(duì)PR39作用的影響，結(jié)果表明，抑制Rac1的活化后，PR39對(duì)豬腸道上皮細(xì)胞通透性的改善作用及對(duì)Occludin表達(dá)量的提升作用均受到抑制。而且，PR39對(duì)沙門氏菌入侵和大腸桿菌粘附的減少作用也被部分抑制。上述結(jié)果表明抗菌肽PR39通過(guò)促進(jìn)Rho GTPase家族成員Ra