豬抗菌肽PR-39的表達(dá)特性和調(diào)控及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、豬PR-39抗菌肽來(lái)源于豬嗜中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞，是含有39個(gè)氨基酸殘基的cathelicidin家族抗菌肽。目前的研究已發(fā)現(xiàn)PR-39可以從豬小腸組織和外周血嗜中性粒細(xì)胞中分離純化得到，對(duì)常見(jiàn)病原微生物具有廣譜抗菌活性，也具有趨化、抑制炎癥、促進(jìn)損傷修復(fù)等免疫功能。但是PR-39在動(dòng)物，特別是仔豬腸道免疫中作用的研究較少。因此，本研究設(shè)計(jì)了三個(gè)試驗(yàn)，首先以抗病力不同的豬種——地方品種萊蕪豬、榮昌豬、藏豬和原產(chǎn)丹麥的長(zhǎng)白豬為模型，比較了

2、豬PR-39抗菌肽基因和腸道先天免疫因子基因表達(dá)的品種差異，在此基礎(chǔ)上，研究了PR-39基因的組織特異性和日齡表達(dá)規(guī)律;進(jìn)一步利用金華豬和長(zhǎng)白豬建立仔豬大腸桿菌K88攻毒模型，探討了細(xì)菌攻毒對(duì)PR-39抗菌肽基因表達(dá)的調(diào)控及其與豬腸道結(jié)構(gòu)和免疫功能的關(guān)系;最后通過(guò)體外巨噬細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)，研究了PR-39抗菌肽對(duì)豬巨噬細(xì)胞極化類(lèi)型和免疫功能的影響，旨在初步闡明豬PR-39抗菌肽在仔豬腸道免疫中的作用。主要研究結(jié)果如下:
　　試驗(yàn)一:豬

3、PR-39抗菌肽基因的品種差異和表達(dá)規(guī)律
　　針對(duì)抗病力不同的地方品種萊蕪豬、榮昌豬和藏豬，以及原產(chǎn)丹麥的長(zhǎng)白豬，首先比較了中國(guó)地方品種豬和長(zhǎng)白豬PR-39抗菌肽和腸道先天免疫關(guān)鍵基因表達(dá)的品種差異。結(jié)果表明，地方品種豬PR-39基因表達(dá)量總體上高于長(zhǎng)白豬，其中榮昌豬在骨髓、胸腺和十二指腸中PR-39基因的表達(dá)量顯著高于長(zhǎng)白豬(p＜0.05)，而藏豬在胸腺和肝臟中的表達(dá)量顯著高于長(zhǎng)白豬(p＜0.05)。腸道先天免疫因子表達(dá)的品種差

4、異結(jié)果表明，地方品種豬中，榮昌豬的腸道主要先天免疫因子表達(dá)水平總體高于長(zhǎng)白豬;細(xì)胞因子方面，來(lái)萊蕪豬和榮昌豬IL-1α和IL-1β表達(dá)量高于長(zhǎng)白豬(p＜0.05)，而萊蕪豬、藏豬IFN-γ的表達(dá)量顯著高于長(zhǎng)白豬(p＜0.05);趨化因子方面，榮昌豬MCP-1和IL-8的表達(dá)量顯著高于長(zhǎng)白豬(p＜0.05)，而藏豬僅MCP-1的表達(dá)量顯著高于長(zhǎng)白豬;主要病原模式識(shí)別受體基因方面，地方品種豬TLR-2，4，5和NOD-1，2基因表達(dá)量總體高

5、于長(zhǎng)白豬，其中榮昌豬TLR-2，4，5以及NOD-1，2基因mRNA表達(dá)量顯著高于長(zhǎng)白豬(p＜0.05)。上述試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，抗病力較高的地方品種豬PR-39抗菌肽與腸道先天免疫因子表達(dá)水平總體上高于長(zhǎng)白豬，揭示豬PR-39抗菌肽及相關(guān)免疫因子的表達(dá)水平可能與不同品種豬的抗病免疫力存在一定的關(guān)系。
　　進(jìn)一步對(duì)PR-39基因組織特異性表達(dá)研究的結(jié)果表明，骨髓是豬PR-39抗菌肽基因表達(dá)的主要部位，脾臟、肝臟、腸系膜淋巴結(jié)和十二指腸等

6、組織中的表達(dá)量較低。日齡表達(dá)規(guī)律結(jié)果顯示，金華豬PR-39的表達(dá)量從出生到90日齡逐漸增加，90到120日齡降低;而長(zhǎng)白豬則PR-39表達(dá)量從出生到60日齡逐漸增加，60到120日齡逐漸降低;總體上PR-39呈現(xiàn)隨日齡先增加后降低的規(guī)律。
　　試驗(yàn)二:大腸桿菌K88攻毒對(duì)仔豬腸道功能和PR-39抗菌肽基因表達(dá)的影響
　　在初步探討PR-39抗菌肽及相關(guān)免疫因子與豬抗病免疫力關(guān)系的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)以金華豬和長(zhǎng)白豬為研究對(duì)象，建立

7、仔豬大腸桿菌K88攻毒模型，比較了攻毒對(duì)兩品種豬生長(zhǎng)性能、腹瀉率、腸道主要微生物數(shù)量、小腸形態(tài)和免疫功能影響，進(jìn)一步探討了細(xì)菌攻毒對(duì)PR-39抗菌肽基因的表達(dá)的影響及其與腸道免疫功能的關(guān)系。
　　生長(zhǎng)性能和腹瀉率的結(jié)果表明:日增重方面;與對(duì)照組金華豬相比，攻毒使金華豬的日增重降低了32.1％(p＜0.05);與對(duì)照組長(zhǎng)白豬相比，攻毒使長(zhǎng)白豬的日增重降低了28.6％，攻毒使金華豬日增重降低的趨勢(shì)低于長(zhǎng)白豬。料重比方面，與各自的對(duì)照組

8、相比，攻毒組的金華豬和長(zhǎng)白豬料重比都有增加的趨勢(shì)，但差異不顯著;攻毒組金華豬的料重比有低于攻毒組長(zhǎng)白豬的趨勢(shì)，但差異不顯著。腹瀉率方面，對(duì)照組的金華豬與長(zhǎng)白豬之間腹瀉率無(wú)顯著差異;與對(duì)照組金華豬相比，攻毒組金華豬腹瀉率有增加的趨勢(shì);與對(duì)照組長(zhǎng)白豬(2.4％)相比，攻毒組長(zhǎng)白豬的腹瀉率(26.2％)顯著增加(p＜0.05);但是攻毒組金華豬的腹瀉率(7.1％)顯著低于攻毒組長(zhǎng)白豬(26.2％)(p＜0.05);攻毒使金華豬腹瀉率增加的程度

9、顯著地低于長(zhǎng)白豬(p＜0.05)。
　　腸道主要微生物數(shù)量的結(jié)果表明:大腸桿菌數(shù)量及其占總菌比例方面，對(duì)照組金華豬結(jié)腸大腸桿菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組長(zhǎng)白豬(p＜0.05)，大腸桿菌占總菌的比例也有低于長(zhǎng)白豬的趨勢(shì);與對(duì)照組金華豬相比，攻毒組金華豬結(jié)腸大腸桿菌數(shù)量顯著增加(p＜0.05)，大腸桿菌占總菌的比例有增加的趨勢(shì);與對(duì)照組長(zhǎng)白豬相比，攻毒組長(zhǎng)白豬結(jié)腸大腸桿菌數(shù)量及其占總菌比例均顯著增加(p＜0.05);攻毒組金華豬大腸桿菌的數(shù)量

10、及其占總菌的比例都顯著地低于攻毒組長(zhǎng)白豬(p＜0.05);攻毒使金華豬大腸桿菌的數(shù)量及比例增加的趨勢(shì)要低于長(zhǎng)白豬。乳酸桿菌數(shù)量及其占總苗比例方面，對(duì)照組金華豬結(jié)腸乳酸桿菌及其占總菌的比例與對(duì)照組長(zhǎng)白豬無(wú)顯著差別;與對(duì)照組金華豬相比，攻毒組金華豬結(jié)腸乳酸桿菌數(shù)量及其比例無(wú)顯著變化;而與對(duì)照組長(zhǎng)白豬相比，攻毒組長(zhǎng)白豬結(jié)腸乳酸桿菌數(shù)量顯著降低(p＜0.05)，乳酸桿菌占總菌的比例有降低的趨勢(shì);攻毒組金華豬結(jié)腸乳酸桿菌的數(shù)量及其占總菌的比例有高

11、于攻毒組長(zhǎng)白豬的趨勢(shì)，并且攻毒對(duì)金華豬乳酸桿菌數(shù)量降低的程度顯著低于長(zhǎng)白豬(p＜0.05)。乳酸桿菌/大腸桿菌的比值方面，對(duì)照組金華豬乳酸桿菌/大腸桿菌比值顯著地高于長(zhǎng)白豬(p＜0.05);與各自的對(duì)照組相比，攻毒組的金華豬和長(zhǎng)白豬乳酸桿菌/大腸桿菌比值都顯著地降低(p＜0.05);雖然攻毒對(duì)金華豬乳酸桿菌/大腸桿菌比值降低的趨勢(shì)要顯著地高于長(zhǎng)白豬(p＜0.05)，但是攻毒組金華豬該比值仍然有高于攻毒組長(zhǎng)白豬的趨勢(shì)。
　　小腸形態(tài)

12、結(jié)構(gòu)與緊密連接蛋白基因表達(dá)的結(jié)果表明:小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)方面，大腸桿菌K88攻毒對(duì)金華豬和長(zhǎng)白豬小腸的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)均造成了破壞;各腸段中，攻毒對(duì)回腸的影響最明顯——與對(duì)照組金華豬相比，攻毒組金華豬回腸絨毛高度和絨毛/隱窩比值都顯著降低(p＜0.05);長(zhǎng)白豬也觀察到類(lèi)似的結(jié)果，與對(duì)照組長(zhǎng)白豬相比，攻毒組長(zhǎng)白豬回腸絨毛高度和絨毛/隱窩比值也都顯著降低(p＜0.05);攻毒組金華豬小腸絨毛高度與絨毛/隱窩比值有高于攻毒組長(zhǎng)白豬的趨勢(shì)。腸道緊密連接

13、蛋白基因表達(dá)水平方面，與各自的對(duì)照組相比，攻毒組的金華豬和長(zhǎng)白豬十二指腸、空腸、回腸中緊密連接蛋白claudin-1、occludin、ZO-1和ZO-2基因的表達(dá)水平總體上都明顯降低。各腸段中，攻毒對(duì)仔豬空腸緊密連接蛋白基因變化的影響最明顯——與對(duì)照組金華豬相比，攻毒組金華豬空腸occludin、ZO-1和ZO-2表達(dá)水平顯著降低(p＜0.05)，claudin-1表達(dá)有降低的趨勢(shì);與對(duì)照組長(zhǎng)白豬相比，攻毒組長(zhǎng)白豬空腸occludin

14、表達(dá)水平顯著降低(p＜0.05)，claudin-1、ZO-1和ZO-2表達(dá)有降低的趨勢(shì);攻毒組金華豬occludin表達(dá)水平顯著高于攻毒組長(zhǎng)白豬(p＜0.05)，claudin-1、ZO-1和ZO-2有高于長(zhǎng)白豬的趨勢(shì)。雖然攻毒使金華豬緊密連接蛋白水平降低的程度要高于長(zhǎng)白豬，但是金華豬無(wú)論是對(duì)照組或是攻毒組，緊密連接蛋白的表達(dá)水平總體上都高于長(zhǎng)白豬。
　　免疫球蛋白和腸道免疫因子的結(jié)果表明:免疫球蛋白水平方面，對(duì)照組金華豬與對(duì)照

15、組長(zhǎng)白豬相比，免疫球蛋白IgA和IgG水平均無(wú)顯著差異;與對(duì)照組金華豬相比，攻毒組金華豬血清IgA和IgG的水平顯著增加(p＜0.05)，;與對(duì)照組長(zhǎng)白豬相比，攻毒組長(zhǎng)白豬血清IgA和IgG有增加的趨勢(shì);攻毒組金華豬的IgG水平顯著高于攻毒組長(zhǎng)白豬(p＜0.05)，而IgA水平與攻毒組長(zhǎng)白豬相比無(wú)顯著差異，提示金華豬具有較強(qiáng)的抗體生成能力。腸道sIgA方面，對(duì)照組金華豬與對(duì)照組長(zhǎng)白豬相比，回腸sIgA水平無(wú)顯著差異;與各自的對(duì)照組相比，

16、攻毒組的金華豬和長(zhǎng)白豬回腸sIgA水平都顯著增加(p＜0.05)，提示攻毒一定程度上激活了腸道粘膜免疫;攻毒組金華豬sIgA有高于攻毒組長(zhǎng)白豬的趨勢(shì)。腸道細(xì)胞因子方面，對(duì)照組金華豬回腸中促炎性細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6和抗炎細(xì)胞因子TGF-β的水平顯著高于對(duì)照組長(zhǎng)白豬(p＜0.05)，而抗炎細(xì)胞因子IL-4水平顯著低于長(zhǎng)白豬(p＜0.05);與對(duì)照組金華豬相比，攻毒組金華豬促炎性細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-6水平

17、顯著增加(p＜0.05),而抗炎細(xì)胞因子TGF-β和IL-4水平顯著降低(p＜0.05);與對(duì)照組長(zhǎng)白豬相比，攻毒組長(zhǎng)白豬促炎性細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α水平顯著增加(p＜0.05)，IL-6水平有增加的趨勢(shì)，抗炎細(xì)胞因子TGF-β和IL-4水平顯著降低(p＜0.05);攻毒對(duì)金華豬TNF-α增加的趨勢(shì)以及對(duì)IL-4降低的趨勢(shì)均顯著地低于長(zhǎng)白豬(p＜0.05)，提示與攻毒組長(zhǎng)白豬相比，攻毒組金華豬的腸道炎癥反應(yīng)程度較輕。
　　

18、在比較了大腸桿菌K88攻毒對(duì)金華豬和長(zhǎng)白豬生長(zhǎng)性能、腹瀉率、腸道主要微生物數(shù)量、小腸形態(tài)和腸道免疫等功能影響的基礎(chǔ)上，對(duì)不同組織中PR-39抗菌肽基因表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果表明:在骨髓、脾臟、胸腺、肝臟、肺和回腸組織中，對(duì)照組金華豬PR-39抗菌肽基因表達(dá)水平有高于對(duì)照組長(zhǎng)白豬的趨勢(shì)，在腸系膜淋巴結(jié)中，對(duì)照組金華豬PR-39表達(dá)水平顯著高于長(zhǎng)白豬(p＜0.05);與對(duì)照組金華豬相比，攻毒組金華豬PR-39基因在骨髓、脾臟和回腸中的表達(dá)水平顯著

19、增加(p＜0.05);而攻毒組長(zhǎng)白豬與對(duì)照組相比，在骨髓、脾臟和回腸中的表達(dá)水平有增加的趨勢(shì);攻毒組金華豬在骨髓、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)和回腸組織中PR-39的表達(dá)水平顯著高于攻毒組長(zhǎng)白豬(p＜0.05)，并且攻毒對(duì)金華豬骨髓和脾臟PR-39表達(dá)水平增加的趨勢(shì)顯著高于長(zhǎng)白豬(p＜0.05)。
　　本試驗(yàn)結(jié)果表明，與長(zhǎng)白豬相比，金華豬為大腸桿菌K88受體抵抗基因型，攻毒對(duì)其日增重降低的趨勢(shì)、腹瀉率增加的趨勢(shì)、結(jié)腸大腸桿菌增加和乳酸桿菌減

20、少的趨勢(shì)影響較小，同時(shí)金華豬在攻毒后維持了較好的小腸形態(tài)與較高的緊密連接蛋白基因表達(dá)水平，腸道炎癥反應(yīng)的程度顯著低于長(zhǎng)白豬;上述表現(xiàn)可能與金華豬攻毒后PR-39抗菌肽被誘導(dǎo)增加的程度，以及PR-39的表達(dá)水平顯著高于長(zhǎng)白豬有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果初步揭示，豬內(nèi)源性抗菌肽PR-39能夠受到大腸桿菌K88攻毒的誘導(dǎo)表達(dá)，并可能參與了對(duì)仔豬腸道微生物、屏障和黏膜免疫等多種腸道功能的調(diào)節(jié)。
　　試驗(yàn)三:豬PR-39抗菌肽對(duì)巨噬細(xì)胞極化類(lèi)型和免疫功

21、能的影響
　　在初步闡明PR-39抗菌肽與豬腸道免疫功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)以豬巨噬細(xì)胞3D4/2為體外研究對(duì)象，探討了豬PR-39抗菌肽對(duì)大腸桿菌感染豬巨噬細(xì)胞的影響，并進(jìn)一步研究了PR-39對(duì)豬巨噬細(xì)胞極化類(lèi)型和免疫功能的影響。PR-39對(duì)大腸桿菌感染豬巨噬細(xì)胞影響的試驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)菌感染破壞了豬巨噬細(xì)胞的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)，顯著增加了巨噬細(xì)胞LDH釋放率，并顯著增加了促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-8以及環(huán)氧合酶COX-

22、2的表達(dá)(p＜0.05);而加入抗菌肽PR-39能夠明顯緩解感染引起的LDH釋放和上述炎癥介質(zhì)的表達(dá)。PR-39對(duì)豬巨噬細(xì)胞極化類(lèi)型影響的試驗(yàn)中，利用IFN-γ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的M1型極化，M-CSF和IL-4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的M2型極化。試驗(yàn)結(jié)果表明，PR-39協(xié)同誘導(dǎo)M1型（主要發(fā)揮吞噬、清除病原和凋亡細(xì)胞的作用）巨噬細(xì)胞極化時(shí)，與M1型巨噬細(xì)胞相比，顯著提高了M1型標(biāo)識(shí)基因IL-12p40、TNF-α、IL-6，以及M1型極化關(guān)鍵信號(hào)分子

23、STAT-1基因的表達(dá)(p＜0.05)，表明PR-39促進(jìn)了豬巨噬細(xì)胞向M1型極化;PR-39協(xié)同誘導(dǎo)M2型（主要發(fā)揮組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)的作用）巨噬細(xì)胞極化時(shí)，與M2型巨噬細(xì)胞相比，顯著降低了M2型標(biāo)識(shí)基因IL-10和TGF-β基因的表達(dá)(p＜0.05)，卻增加了M1型標(biāo)識(shí)基因IL-12p40和COX-2的表達(dá)(p＜0.05)，表明PR-39一定程度上抑制了豬巨噬細(xì)胞的M2型極化，并促進(jìn)M2型向M1型轉(zhuǎn)化。
　　PR-39協(xié)同誘導(dǎo)

24、對(duì)豬巨噬細(xì)胞免疫功能影響的結(jié)果表明:PR-39協(xié)同誘導(dǎo)首先顯著促進(jìn)了豬巨噬細(xì)胞的吞噬功能;與空白對(duì)照組相比，PR-39組豬巨噬細(xì)胞的吞噬率顯著增加(p＜0.05);與M1型巨噬細(xì)胞相比，PR-39協(xié)同誘導(dǎo)M1型的吞噬率顯著增加(p＜0.05)，說(shuō)明PR-39顯著促進(jìn)了M1型豬巨噬細(xì)胞的吞噬功能;與空白對(duì)照和M1型巨噬細(xì)胞相比，M2型巨噬細(xì)胞的吞噬率顯著低于上述兩組(p＜0.05)，提示M2型巨噬細(xì)胞吞噬功能較弱;而與M2型巨噬細(xì)胞相比，

25、PR-39協(xié)同誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞的吞噬率顯著提高(p＜0.05)，說(shuō)明PR-39具有增強(qiáng)M2型巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用。PR-39對(duì)大腸桿菌粘附與入侵巨噬細(xì)胞的影響結(jié)果表明，添加PR-39協(xié)同誘導(dǎo)顯著抑制了大腸桿菌對(duì)豬巨噬細(xì)胞的粘附與入侵;與空白對(duì)照組相比，PR-39單獨(dú)處理顯著降低了粘附與入侵豬巨噬細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)量(p＜0.05); M1型和PR-39協(xié)同誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)量均顯著低于空白對(duì)照組(p＜0.05)，說(shuō)明M1型和PR-

26、39協(xié)同誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞均具有抑制大腸桿菌粘附與入侵的作用。M2型巨噬細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)量與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，而添加PR-39協(xié)同誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組和M2型(p＜0.05)，說(shuō)明M2型巨噬細(xì)胞基本不抑制細(xì)菌的粘附與入侵，而PR-39顯著增強(qiáng)了M2型巨噬細(xì)胞抑制細(xì)菌粘附與入侵的能力。上述試驗(yàn)結(jié)果揭示，PR-39抗菌肽能夠緩解大腸桿菌感染引起的豬巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞損傷，并可通過(guò)協(xié)同誘導(dǎo)促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化，

27、增強(qiáng)了豬巨噬細(xì)胞的吞噬功能，抑制了細(xì)菌對(duì)巨噬細(xì)胞的粘附與入侵。
　　綜上所述，通過(guò)以上三個(gè)試驗(yàn)，揭示了豬PR-39抗菌肽及相關(guān)免疫因子的表達(dá)水平可能與不同品種豬的抗病免疫力有關(guān)，并通過(guò)仔豬大腸桿菌攻毒試驗(yàn)，證明了金華豬對(duì)大腸桿菌K88攻毒具有較強(qiáng)的耐受性，可能與金華豬攻毒后較高的PR-39表達(dá)水平密切相關(guān)，進(jìn)一步利用體外巨噬細(xì)胞培養(yǎng)模型，揭示了PR-39可通過(guò)協(xié)同誘導(dǎo)促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化的機(jī)制，增強(qiáng)了豬巨噬細(xì)胞的吞噬功能，并抑