靶向HPVE6E7基因的TALEN的構(gòu)建及應(yīng)用研究.pdf

1、研究目的：
　　1.分析HPV16/18 E6/E7癌基因序列信息，構(gòu)建靶向于HPV16/18 E6/E7不同靶點的TALEN質(zhì)粒，利用體外的報告系統(tǒng)初步篩選出切割效率最好而毒副作用最小的TALEN；同時對TALEN的FokI切割域和骨架系統(tǒng)進行優(yōu)化，篩選出切割效率最高的的TALEN。
　　2.再將TALEN應(yīng)用到各種細胞系中，從E6E7 DNA拷貝數(shù)的變化、細胞內(nèi)靶序列的切割效率、癌蛋白表達情況、細胞凋亡以及細胞增殖等方面

2、驗證TALEN的細胞內(nèi)效應(yīng)和特異性。
　　3.以mRFP表達建立小鼠陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染體系，評價陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的基因表達、分布等情況，再以靶向 EGFP的TALEN質(zhì)粒（TAL-EGFP）轉(zhuǎn)染到系統(tǒng)表達 EGFP的轉(zhuǎn)基因小鼠陰道內(nèi)，利用EGFP熒光表達評價陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染TALEN的作用效果，以此優(yōu)化轉(zhuǎn)染體系，為后續(xù)在轉(zhuǎn)基因小鼠陰道內(nèi)直接轉(zhuǎn)染靶向HPV的TALEN表達質(zhì)粒治療CIN或?qū)m頸癌建立基礎(chǔ)，為CIN或?qū)m頸癌的治療與預(yù)防提供新的策略。

3、r>　　研究方法：
　　1.分析高危性HPV16和HPV18的E6E7癌基因序列，在E6E7癌基因翻譯起始點或主mRNA剪接體的起始外顯子之內(nèi)挑選出作用靶點，利用Golden Gate Assembly的方法構(gòu)建TALEN質(zhì)粒共計16對，隨后利用SSA reporter報告系統(tǒng)對所有的TALEN進行篩選；突變野生型的FokI切割域，將FokI突變體和兩種TALEN骨架進行組合并同樣用SSA reporter系統(tǒng)篩選效率最高毒副作用

4、最小的組合方式進行組裝優(yōu)化。
　　2.將優(yōu)化的TALEN分別轉(zhuǎn)入SiHa、HeLa、C33A、S12和293T細胞系，利用T7E1實驗檢測細胞內(nèi)DSB用于間接反應(yīng)TALEN在細胞內(nèi)的切割效率；熒光原位雜交技術(shù)檢測細胞內(nèi)HPV E6 E7基因的拷貝數(shù)變化；Western blotting檢測HPV16/18 E6 E7癌基因及其下游基因的蛋白表達情況；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡；CCK-8實驗檢測細胞增殖情況。
　　3.采用單次或

5、多次不同劑量給藥的方式在小鼠陰道內(nèi)直接轉(zhuǎn)染mRFP表達質(zhì)粒，小鼠陰道脫落細胞直接鏡下觀察細胞發(fā)光情況，監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率；選取不同給藥劑量的不同時間點處死小鼠，取出小鼠宮頸陰道部組織，冰凍切片觀察紅色熒光在組織內(nèi)的分布情況，優(yōu)化陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染的條件；再按照此條件在EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染FLAG標記的靶向EGFP的TAL-EGFP，取組織冰凍切片觀察EGFP綠光變化情況，再用4％多聚甲醛固定后石蠟包埋切片，通過攜帶的FLAG標簽的免疫組化染色

6、確定TAL-EGFP質(zhì)粒的表達在組織內(nèi)的分布情況。通過HE染色和小鼠CD45的免疫組化染色確定轉(zhuǎn)染是否誘導(dǎo)局部的炎癥。
　　研究結(jié)果：
　　1.經(jīng)過SSA reporter系統(tǒng)的篩選，所有構(gòu)建的16對TALEN質(zhì)粒均能有效的切割DNA，切割效率最好的分別是靶向于HPV16 E6的T27，靶向于HPV16 E7的T512，靶向于HPV18 E6的T34和靶向于HPV18 E7的T519；+63截短型骨架與S+KKR/ELD的突

7、變型FokI的組合的切割效率最高，因此將上述4對TALEN質(zhì)粒全部裝上這一骨架系統(tǒng)。
　　2.將優(yōu)化的4對TALEN分別轉(zhuǎn)入SiHa、HeLa、C33A、S12和293T細胞后，(1) T7E1實驗檢測經(jīng)T27或T512處理的SiHa和S12細胞、T34或T519轉(zhuǎn)染的HeLa細胞樣品均得到陽性的結(jié)果。(2)熒光原位雜交技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)T512轉(zhuǎn)染后的SiHa和S12細胞里的HPV16 DNA拷貝數(shù)降低，T519處理后的HeLa細胞里

8、的HPV18 DNA拷貝數(shù)降低。(3) Western blotting結(jié)果顯示T27、T34能特異性的誘導(dǎo)HPV16 E6和HPV18 E6蛋白的下調(diào)，同時檢測到E6下游的靶蛋白p53的上調(diào)；T512、T519能特異性的誘導(dǎo)HPV16 E7和HPV18 E7蛋白的下調(diào)，以及E7下游的CDK2蛋白的表達上調(diào)。(4)細胞凋亡結(jié)果顯示T27和T512僅能引起HPV16陽性的細胞系SiHa和S12的明顯凋亡，對HPV18陽性的HeLa無明顯誘

9、導(dǎo)凋亡作用；T34和 T519僅能引起HeLa的凋亡，而對SiHa無明顯作用；所有這4對TALEN對HPV陰性的宮頸癌細胞系C33A和正常人胚腎細胞系293T都無誘導(dǎo)凋亡作用。(5)細胞增殖實驗顯示， T27和T512僅特異性的抑制SiHa和S12的細胞增殖，對HeLa、C33A、293T的生長無明顯抑制作用；T34和T519僅特異性的抑制HeLa的增殖，對其他4株細胞系均無明顯影響。
　　3.mRFP質(zhì)粒在小鼠陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染后48小

10、時即可檢測到明顯的發(fā)光情況，并且至少6天內(nèi)可觀察到熒光；通過比較不同濃度不同轉(zhuǎn)染量的發(fā)光情況，對陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染體系進一步的優(yōu)化；觀察到轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒表達范圍大部分限定在宮頸和陰道的上皮內(nèi)；陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染的TAL-EGFP可以在體內(nèi)有效的切割EGFP表達序列，阻止EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠陰道內(nèi)的EGFP蛋白的繼續(xù)表達，使得宮頸陰道局部的EGFP熒光減弱甚至消失；證明體內(nèi)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對局部無損傷，不會誘導(dǎo)急性炎性反應(yīng)。
　　研究結(jié)論：
　　1.對構(gòu)建

11、出8對靶向于HPV16 E6E7和8對靶向于HPV18 E6E7的TALEN質(zhì)粒進行篩選后得出效果最好的4對分別是靶向于HPV16 E6的T27，靶向于HPV16 E7的T512，靶向于HPV18 E6的T34和靶向于HPV18 E7的T519，并對FokI切割域和骨架系統(tǒng)進行了優(yōu)化。
　　2.T27、T512、T34和T519在相應(yīng)HPV陽性的細胞內(nèi)有效的切割靶向HPV序列，引起HPV拷貝數(shù)的降低，相應(yīng)HPV癌基因表達的下調(diào)以及