特異性NF-κBp65siRNA干擾對THP-1細胞增殖與凋亡的影響.pdf

1、研究背景:
　　 急性白血病是一類嚴重危害兒童健康的腫瘤性疾病,根據增生的白細胞種類不同,分為急性淋巴細胞白血病(acute lymphocytic leukemia,ALL)和急性髓細胞白血病(acute myelogenous leukemia,AML)兩大類。其中AML約占兒童急性白血病的25～30％,除急性早幼粒細胞白血病外,余各型化療效果、緩解率及5年無病生存率均較差。因此開發(fā)新的AML治療方法,改善AML患兒的預后,

2、成為兒科血液工作者亟待解決的課題。
　　 核轉錄因子(nuclear factor kappa B,NF-κB)是近年發(fā)現(xiàn)的與細胞增殖、凋亡密切相關的一類轉錄因子。NF-κ3家族有5個成員,彼此結合以同源或異源二聚體的形式存在于細胞質中,其中由p50和p65亞基組成的異源二聚體p50／p65是發(fā)現(xiàn)時間最早、分布最為廣泛、主要發(fā)揮作用的一類核轉錄因子,可與多種啟動子和／或增強子的序列特異性結合,促進轉錄的發(fā)生,在免疫應答、炎癥反應

3、及細胞增殖與凋亡等病理生理過程中發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn),NF-κB的不適當激活與血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、增殖、轉移及細胞耐藥密切相關,對NF-κB進行調控目前已經成為抗腫瘤治療的熱點。
　　 近年,新興的RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術為進一步研究NF-κB的功能提供了技術支持。RNAi是指通過人為方式將與內源性mRNA互補的雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)導入細胞,引

4、起特定mRNA的降解,編碼的基因不能表達,引發(fā)相應基因沉默的技術,具有高效、特異性、細胞毒性低等特點,也是基因治療的方法之一。
　　 急性單核細胞白血病是兒童AML中化療緩解率、預后差的幾種類型之一,主要表現(xiàn)為異常的原始及幼稚單核細胞的惡性增殖及凋亡受抑。本課題組前期試驗證實,在兒童急性單核細胞白血病細胞株THP-1中有NF-κB的持續(xù)激活。設想可通過RNAi技術抑制NF-κB的表達,促進THP-1細胞的凋亡,在體外研究中為AM

5、L的基因治療提供一個新的治療靶點。
　　 研究目的:
　　 本實驗通過應用特異性NF-κB p65 siRNA轉染THP-1細胞,觀察其對THP-1細胞增殖與凋亡的影響及可能機制。
　　 研究方法:
　　 體外培養(yǎng)THP—1細胞,將處于指數生長期的細胞進行分組:①空白對照組,使用PBS液處理細胞；②陰性對照組,即NC組,應用control siRNA轉染THP-1細胞；③實驗組,應用NF-κB p65 s

6、iRNA轉染THP-1細胞。采用半定量RT-PCR及Western Blot方法分別檢測p65、CyclinD1及IκBα的基因及蛋白的表達,末端脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧三磷酸尿苷缺口末端標記法(TUNEL)、AnnexinV／PI檢測細胞凋亡,CCK-8測定細胞增殖。
　　 實驗結果:
　　 1.Control siRNA轉染THP-1細胞的效率
　　 應用熒光素標記的control siRNA—FITC轉染

7、THP—1細胞,通過熒光顯微鏡觀察轉染效率,結果顯示轉染24小時的效率最高,達60％以上。
　　 2.NF-κB p65 siRNA干擾效應的檢測
　　 RT-PCR.結果顯示,實驗組p65 mRNA表達明顯減低,以48小時作用最為明顯,抑制率達(75.52±4.02)％,而空白對照組及陰性對照組則無明顯改變；Western Blot結果顯示轉染48小時,空白對照組、陰性對照組及實驗組中p65蛋白相對含量依次為2.41±

8、0.11、2.33±0.09、0.82±0.10,p65 siRNA干擾組明顯減低(P<0.01),對蛋白抑制率達(74.68±5.27)％。表明NF-κB p65 siRNA可有效地干擾了p65 mRNA及蛋白的表達,于48小時干擾效應最明顯。
　　 3.NF-κB p65 SiRNA對CyclinD1mRNA及蛋白表達的影響
　　 RT-PCR及Western Blot結果顯示,轉染48小時后,實驗組CyclinD1

9、 mRNA及蛋白的表達明顯減低,而空白對照組及陰性對照組則無明顯改變。表明NF-κBp65 siRNA可有效抑制CyclinD1 mRNA及蛋白表達。
　　 4 NF-κB p65 siRNA對IκBαmRNA及蛋白表達的影響
　　 RT-PCR結果顯示,干擾48小時,實驗組IκBαmRNA表達增加,表達率達(1.25±0.05),而空白對照組及陰性對照組則無明顯改變；Western Blot結果顯示空白對照組、陰性對照

10、組及實驗組中IκBα蛋白表達依次為0.76±0.06、0.81±0.02、1.14±0.06,p65 siRNA干擾組明顯升高(P<0.01)。表明NF-κB p65 siRNA作用后IκBα表達增加。
　　 5 NF-κB p65 siRNA對THP-1細胞凋亡的影響
　　 流式細胞術結果顯示轉染48小時,實驗組THP-1細胞凋亡率(8.49±0.14)％較空白組(2.77±0.46)％及陰性對照組(2.88±0.61

11、)％顯著增加(P<0.05),TUNEL方法結果顯示轉染48小時,實驗組THP-1細胞凋亡率(16.47±1.75)％較空白組(4.30±1.47)％及陰性對照組(3.69±0.86)％％著增加(P<0.05)。
　　 6 NF-κB p65 siRNA干擾對THP-1細胞增殖的影響
　　 CCK-8結果顯示:與空白組及陰性對照組相比較,NF-κB p65 siRNA作用的實驗組細胞增殖速度在第2天速度明顯減慢,缺乏指數