T-cadherin受體在脂聯(lián)素抑制缺氧-復氧導致的乳鼠心肌細胞凋亡中的作用.pdf

1、第一部分:乳鼠心肌細胞的培養(yǎng)以及腺病毒介導干擾RNA的轉(zhuǎn)染
　　 目的:原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，確定腺病毒介導的干擾RNA體外轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細胞的最佳MOI值。
　　 方法:
　　 (1)乳鼠心肌細胞的原代培養(yǎng)
　　 取剛出生72小時內(nèi)的SD乳鼠，消毒，開胸，取左心室部分，冰浴的D-hanks液中洗滌，剪碎。膠原酶Ⅱ消化3-5次，離心，收集細胞，20％血清的培養(yǎng)液混懸，差速貼壁90分鐘，收集培養(yǎng)液中的非貼壁細

2、胞，種于6孔板，48小時更換培養(yǎng)基，用倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)和自發(fā)搏動情況。
　　 (2)心肌細胞的鑒定:針對胞漿中α-actin和肌鈣蛋白cTnT，分別采用免疫熒光法和免疫組織化學法對心肌細胞進行鑒定。
　　 (3)Ad-siRNA體外靶向性轉(zhuǎn)染心肌細胞最佳滴度檢測
　　 體外原代培養(yǎng)乳鼠的心肌細胞，將腺病毒介導的干擾RNA按不同的MOI值進行轉(zhuǎn)染。通過倒置熒光顯微鏡、流式細胞儀確定此腺病毒體外轉(zhuǎn)染心肌細胞

3、的最佳MOI值，并確定其安全性和感染力。
　　 結(jié)果:
　　 (1)倒置顯微鏡下觀察:原代培養(yǎng)細胞24小時后可貼壁，48小時后出現(xiàn)自發(fā)博動，72小時后細胞間形成細胞連接，成簇生長。
　　 (2)經(jīng)免疫熒光法和免疫組織化學法鑒定培養(yǎng)的細胞為心肌細胞，且純度可達95％以上。
　　 (3)倒置熒光顯微鏡以及流式細胞術(shù)檢測腺病毒的轉(zhuǎn)染效率:轉(zhuǎn)染后72h，MOI值為100時，腺病毒的紅色熒光表達最強，感染效率高于9

4、0％。
　　 結(jié)論:本實驗成功培養(yǎng)了乳鼠心肌細胞，并且確定了腺病毒介導的siRNA在體外安全有效的轉(zhuǎn)染原代心肌細胞的佳MOI值。
　　 第二部分:APN/T-cadher in在缺氧/復氧導致乳鼠心肌細胞凋亡中的作用
　　 目的:建立心肌細胞缺氧/復氧(H/R)模型，同時使用腺病毒介導的干擾RNA技術(shù)體外沉默脂聯(lián)素受體T-cadherin的表達，觀察APN/T-cadherin對缺氧/復氧所致心肌細胞凋亡的影響。

5、
　　 方法:選用原代培養(yǎng)72小時的單層心肌細胞隨機進行實驗，隨機分為5組:①空白對照組:心肌細胞正常培養(yǎng);②缺氧/復氧組;③脂聯(lián)素+缺氧/復氧組④脂聯(lián)素+缺氧/復氧+ Ad-T-cadherin-siRNA組;⑤缺氧/復氧+脂聯(lián)素+Ad-siRNA（腺病毒陰性對照）組。倒置熒光顯微鏡下觀察各組心肌細胞的形態(tài)以及自發(fā)搏動情況;在MOI值為100，轉(zhuǎn)染72h后，用Real Time-PCR和Western blot方法檢測各組細胞

6、T-cadherin的表達的情況;流式細胞術(shù)，脫氧核糖核菅酸缺口末端標記法(TUNEL)檢測各組心肌細胞的凋亡。
　　 結(jié)果:(1)各組心肌細胞形態(tài)學比較:H/R組細胞生長狀態(tài)差，細胞自發(fā)搏動率減弱。而H/R+APN組，多數(shù)細胞結(jié)構(gòu)接近正常，細胞搏動較快。H/R+APN+Ad-T-cadherin-siRNA組，多數(shù)細胞狀態(tài)差，自發(fā)搏動較H/R+APN組明顯減慢。H/R+APN+Ad-HK組，細胞狀態(tài)良好。
　　 (2)

7、 RT-PCR和Western blot印跡分析的結(jié)果顯示:各組均可以檢測到T-cadherin mRNA和蛋白的表達，其中與正常組比較，H/R組T-cadherin的表達明顯降低，差異顯著(P＜0.05)。給予脂聯(lián)素預處理后，T-cadherin的表達明顯增高，與H/R組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。APN+H/R+Ad-T-cad-siRNA組T-cadherin mRNA和蛋白表達也明顯降低，與APN+H/R組比較，差異顯

8、著(P＜0.05)。
　　 (3)流式以及TUNEL結(jié)果均顯示:與正常組比較，H/R組細胞的凋亡明顯增多，差異顯著(P＜0.05)。給予脂聯(lián)素預處理后，心肌細胞的凋亡比較與單純的H/R組，凋亡明顯降低(P＜0.05)。與H/R十APN組相比，APN+H/R+Ad-T-cad-siRNA組心肌細胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而與單純H/R組相比，凋亡率差異不明顯(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:(1).