豬胸膜肺炎放線桿菌PCR檢測方法及其外膜脂蛋白基因的表達.pdf

1、豬胸膜肺炎放線桿菌(actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起豬傳染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP),給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失.大量研究工作證實,APP的外膜脂蛋白(outer membrane lipoprotein,OML)具有較好的免疫原性,在PCP的免疫預防中起著重要作用.本實驗參考已發(fā)表的APP OML基因序列,設計合成引物,通過P

2、CR方法,將APP QH-1、HN-7菌株的OML基因克隆到pMD18-T載體中,構建重組質粒AppOml-1和AppOml-7并進行序列測定分析.結果表明,QH-1株OML基因的核苷酸序列與參考菌株1、9、11、12血清型的同源性高達99.1﹪以上,HN-7株OML基因的核苷酸序列與參考菌株3、4、6、7血清型的同源性高達97.3﹪以上,而與其它血清型參考菌株的同源性較低.對OML基因進行序列分析發(fā)現(xiàn),在其開放閱讀框架(open re

3、ading frame,ORF)兩端存在種間保守序列.據此設計一對特異性引物,經PCR擴增,APP1~10血清型標準菌株均能擴增出大小為980 bp的DNA片段,而對其它具有類似癥狀的豬呼吸道病原菌擴增結果均為陰性.檢測APP DNA的最低濃度為2 pg/mL.將臨床分離的6株APP進行PCR檢測,均為陽性,與病原學鑒定的符合率為100﹪.由此證實,此方法可以進行APP的快速檢測.利用PCR技術從重組質粒AppOml-1中擴增出包含完整

4、ORF的cAppOML-1基因,用EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ雙酶切cAppOML-1基因片段,定向亞克隆到經同樣酶切處理的帶有6個組氨酸標簽的表達載體pP<,R>oEX HTb中,構建重組質粒pP<,R>ocAppOml-1,轉入大腸桿菌BL21,對陽性克隆測序確認閱讀框正確后,用IPTG進行誘導,收集不同時間的菌液進行SDS-PAGE電泳,對表達蛋白進行Western-blot分析.結果表明,cAppOml-1基因在大腸桿菌中能成功表達