分月扇舟蛾幾丁質酶dsRNA轉化楊樹及其抗蟲性的研究.pdf

1、幾丁質酶基因作為昆蟲中重要的一種酶類基因，參與生物體生長發(fā)育期間的蛻皮及新表皮的形成過程。RNAi(RNA interence)作為一種重要的基因沉默方式，它在研究生物基因功能和防治方面得到了廣泛的應用和研究。本文對分月扇舟蛾的幾丁質酶基因進行了克隆，并根據其基因序列進行了它的生物信息學分析。以山新楊的葉片作為外植體，構建了幾丁質酶基因Chi干涉表達載體pBI121-Chif-intron-Chir，利用根癌農桿菌介導法對山新楊進行遺傳

2、轉化，并對轉化株系進行了篩選、PCR檢測，Chi基因的表達量的檢測，并對其進行了抗蟲性的研究，獲得了如下主要結果:
　　1、采用STE法提取分月扇舟蛾的RNA，并通過反轉錄獲得cDNA，利用PCR技術對分月扇舟蛾的幾丁質酶基因進行了克隆，并根據其測序的序列對其進行基因的序列分析，了解它的氨基酸組成及含量，對其氨基酸序列進行了保守區(qū)和神經肽的預測，并與其氨基酸序列相似的27種幾丁質酶基因進行了多序列對比并作出進化樹，構建出幾丁質酶基

3、因的蛋白質三級結構模型。
　　2、提取分月扇舟蛾的基因組DNA，利用PCR技術克隆得到分月扇舟蛾神經肽PBAN基因的第三個內含子部分序列。以分月扇舟蛾的RNA為模版，利用PCR技術克隆得到Chi基因的保守區(qū)部分序列，然后將其正向和反向與PBAN基因內含子基因片段通過酶切連接轉化等一系列的操作構建到中間載體pUC19上，并以卡納霉素作為篩選基因抗生素的干涉表達載體pBI121-Chif-intron-Chir。最后將重組載體成功的導

4、入到農桿菌EHA105中。
　　3、以山新楊作為外植體，對其進行抗生素的敏感性測定，并建立了最佳的遺傳轉化體系，通過選擇培養(yǎng)獲得了具有目的片段的轉基因山新楊植株，并通過PCR技術最終確定獲得了7株具有目的片段的轉基因山新楊植株，通過熒光定量PCR確定了7種轉基因山新楊株系中表達量T4＞T7＞T2＞T6＞T5＞T3＞T1.
　　4、對含有Chi基因的RNAi轉基因山新楊進行組織培養(yǎng)，擴大繁殖，飼喂分月扇舟蛾通過熒光定量PCR發(fā)