分月扇舟蛾幾丁質(zhì)酶dsRNA轉(zhuǎn)化楊樹及其抗蟲性的研究.pdf

1、幾丁質(zhì)酶基因作為昆蟲中重要的一種酶類基因，參與生物體生長發(fā)育期間的蛻皮及新表皮的形成過程。RNAi(RNA interence)作為一種重要的基因沉默方式，它在研究生物基因功能和防治方面得到了廣泛的應(yīng)用和研究。本文對分月扇舟蛾的幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行了克隆，并根據(jù)其基因序列進(jìn)行了它的生物信息學(xué)分析。以山新楊的葉片作為外植體，構(gòu)建了幾丁質(zhì)酶基因Chi干涉表達(dá)載體pBI121-Chif-intron-Chir，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對山新楊進(jìn)行遺傳

2、轉(zhuǎn)化，并對轉(zhuǎn)化株系進(jìn)行了篩選、PCR檢測，Chi基因的表達(dá)量的檢測，并對其進(jìn)行了抗蟲性的研究，獲得了如下主要結(jié)果:
　　1、采用STE法提取分月扇舟蛾的RNA，并通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用PCR技術(shù)對分月扇舟蛾的幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行了克隆，并根據(jù)其測序的序列對其進(jìn)行基因的序列分析，了解它的氨基酸組成及含量，對其氨基酸序列進(jìn)行了保守區(qū)和神經(jīng)肽的預(yù)測，并與其氨基酸序列相似的27種幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行了多序列對比并作出進(jìn)化樹，構(gòu)建出幾丁質(zhì)酶基

3、因的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模型。
　　2、提取分月扇舟蛾的基因組DNA，利用PCR技術(shù)克隆得到分月扇舟蛾神經(jīng)肽PBAN基因的第三個(gè)內(nèi)含子部分序列。以分月扇舟蛾的RNA為模版，利用PCR技術(shù)克隆得到Chi基因的保守區(qū)部分序列，然后將其正向和反向與PBAN基因內(nèi)含子基因片段通過酶切連接轉(zhuǎn)化等一系列的操作構(gòu)建到中間載體pUC19上，并以卡納霉素作為篩選基因抗生素的干涉表達(dá)載體pBI121-Chif-intron-Chir。最后將重組載體成功的導(dǎo)

4、入到農(nóng)桿菌EHA105中。
　　3、以山新楊作為外植體，對其進(jìn)行抗生素的敏感性測定，并建立了最佳的遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過選擇培養(yǎng)獲得了具有目的片段的轉(zhuǎn)基因山新楊植株，并通過PCR技術(shù)最終確定獲得了7株具有目的片段的轉(zhuǎn)基因山新楊植株，通過熒光定量PCR確定了7種轉(zhuǎn)基因山新楊株系中表達(dá)量T4＞T7＞T2＞T6＞T5＞T3＞T1.
　　4、對含有Chi基因的RNAi轉(zhuǎn)基因山新楊進(jìn)行組織培養(yǎng)，擴(kuò)大繁殖，飼喂分月扇舟蛾通過熒光定量PCR發(fā)