脊髓損傷的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療的實(shí)驗(yàn)研究及臨床不同治療方案的療效對(duì)比研究.pdf

1、第一部分：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞并修復(fù)脊髓損傷的研究
　　目的：脊髓損傷（spinal cord injury, SCI）是由外傷誘發(fā)的一種脊柱外科創(chuàng)傷性疾病，表現(xiàn)為在損傷節(jié)段以下出現(xiàn)感覺、運(yùn)動(dòng)和自主神經(jīng)功能障礙。國(guó)外流行病學(xué)調(diào)查顯示，每年全球有13萬新發(fā)脊髓損傷患者，且有超過250萬患者正飽受著不同程度的脊髓損傷后遺癥困擾，而這些SCI患者每年的醫(yī)療支出將超過60億美元，給家庭及社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)。
　　目前臨床上用

2、于治療SCI的方法主要局限在藥物、手術(shù)及各種物理干預(yù)，SCI的干細(xì)胞治療仍停留在動(dòng)物相關(guān)的基礎(chǔ)研究層面，如骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植、嗅鞘細(xì)胞移植、臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞移植、臍帶華通膠來源間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）移植、NogoA疫苗移植等。由于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有來源廣泛、易擴(kuò)增、無倫理學(xué)方面的限制，已成為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中用于治療脊髓損傷的新熱點(diǎn)和新方向。臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在特定的環(huán)境誘導(dǎo)下可以分化為具有

3、不同功能的組織細(xì)胞，并促進(jìn)保護(hù)性因子的產(chǎn)生，且具有整合、調(diào)節(jié)、遷移和分泌等作用。當(dāng)分化為神經(jīng)細(xì)胞后可以促進(jìn)神經(jīng)組織的修復(fù)，改善脊髓損傷大鼠的神經(jīng)功能。國(guó)內(nèi)有學(xué)者采用移植人臍帶血干細(xì)胞的方法來治療大鼠脊髓損傷，雖獲得了滿意的療效，但存在干細(xì)胞分化效率較低等問題。本研究旨在提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的效率，并將其移植到脊髓損傷小鼠動(dòng)物模型，為脊髓損傷這一難治性疾病提供了理論基礎(chǔ)。
　　方法：采集人臍帶并采用植塊法、膠原

4、酶消化法及膠原酶與胰酶聯(lián)合消化法分離人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs），培養(yǎng)、擴(kuò)增后，將Nurr-1轉(zhuǎn)染到臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，并聯(lián)合雞尾酒因子（ATRA, GGF-2, bFGF, PDGF and forskolin）將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)情況。取昆明系小白鼠進(jìn)行脊髓損傷模型的建立，并將分化后

5、的細(xì)胞移植到脊髓損傷小鼠體內(nèi)，免疫組化檢測(cè)細(xì)胞移植后的定植情況，判斷其治療效果。
　　結(jié)果：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)后，細(xì)胞開始收縮變圓，進(jìn)而變得拉伸后成為多角樣，在持續(xù)增長(zhǎng)的過程中，細(xì)胞的胞體開始拉絲樣出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞的突觸樣結(jié)構(gòu)。誘導(dǎo)2周后，借助免疫熒光檢測(cè)法可以檢測(cè)出神經(jīng)細(xì)胞特有標(biāo)志物MAP-2和MBP存在，且經(jīng)Nurr-1過表達(dá)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的效率最高。造模小鼠的脊髓損傷段結(jié)構(gòu)遭到破壞，灰質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)較多的神經(jīng)

6、元死亡，前角部分神經(jīng)元尚存，其中部分神經(jīng)元可見核固縮。hUCMSCs移植后細(xì)胞在損傷部位大量增殖，熒光顯微鏡下可檢測(cè)到抗人細(xì)胞核陽(yáng)性細(xì)胞，術(shù)后小鼠BBB評(píng)分逐漸提高，后肢運(yùn)動(dòng)功能逐漸改善。
　　結(jié)論：經(jīng)Nurr-1基因轉(zhuǎn)染的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在雞尾酒因子的誘導(dǎo)下可以獲得最好的分化及增殖，移植到受傷脊髓處可以在損傷部位增殖，同時(shí)小鼠的后肢功能獲得明顯改善，表明治療脊髓損傷療效確切。
　　第二部分：無骨折脫位型脊髓損傷手術(shù)與非手術(shù)

7、治療的臨床療效對(duì)比研究
　　目的：無骨折脫位型脊髓損傷（cervical spinal cord injury without fracture or dislocation, CSCIWFD）是一類特殊類型的脊髓損傷，臨床較多間，通常指頸部受到“較輕微”外力損傷后經(jīng)過影像學(xué)檢查，如X線、CT掃描等均未發(fā)現(xiàn)明顯的頸椎骨折或脫位，但脊髓損傷癥狀相對(duì)較重的一類骨科疾病，大約占到頸脊髓損傷總數(shù)的23％。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，CSCIWFD的治療

8、方法主要分為兩種，一種是采用大劑量糖皮質(zhì)激素沖擊、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥物靜點(diǎn)及高壓氧治療的保守治療（非手術(shù)治療），另一類是積極采用外科手段對(duì)脊髓進(jìn)行充分減壓的手術(shù)治療。每種治療方法都可以促使CSCIWFD患者獲得一定程度的神經(jīng)功能恢復(fù)，但手術(shù)干預(yù)作為一種有創(chuàng)性操作，其總體療效是否優(yōu)于非手術(shù)治療呢？針對(duì)此問題，我們進(jìn)行了較深入的臨床對(duì)比研究。
　　方法：回顧性分析2013年10月～2015年9月在門診就診和住院治療的110例CSCIWFD患者

9、的臨床資料，其中92例獲得了超過18個(gè)月的臨床隨訪，根據(jù)患者所接受的治療方法分為兩組：A組（非手術(shù)組），38例，其中男23例，女15例，年齡19～63歲，平均42.1歲，均接受非手術(shù)治療；B組（手術(shù)組），54例，其中男35例，女19例，年齡17～62歲，平均40.8歲，均接受手術(shù)治療。記錄手術(shù)治療組患者的手術(shù)時(shí)間、術(shù)中出血量及并發(fā)癥發(fā)生情況；兩組分別在治療前、治療后1周、治療后1個(gè)月及末次隨訪時(shí)采用日本骨科協(xié)會(huì)（Japanese Ort

10、hopaedic Association, JOA）脊髓損害評(píng)分表（17分法）評(píng)估治療效果；末次隨訪時(shí)根據(jù)ASIA脊髓損傷分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)兩組患者進(jìn)行比較分析。
　　結(jié)果：B組所有患者均順利接受手術(shù)，其中10例患者接受頸前路椎間盤切除植骨內(nèi)固定術(shù)，17例患者接受頸前路椎體次全切除內(nèi)固定術(shù)，16例患者接受頸后路單開門椎管擴(kuò)大成形鈦板固定術(shù)，11例患者接受頸后路全椎板減壓側(cè)塊螺釘固定術(shù)。平均手術(shù)時(shí)間175.2 min，平均出血量為210.6

11、 ml。A組JOA評(píng)分由治療前的7.0±1.8分提高至術(shù)后1周時(shí)的7.9±2.0分、1個(gè)月時(shí)的9.1±2.2分、3個(gè)月時(shí)的9.9±2.3分、6個(gè)月時(shí)的10.5±2.4分和末次隨訪時(shí)的11.2±2.9分，治療前后比較差異具有顯著性（P<0.05），神經(jīng)功能改善率為41.3%±9.6%；B組JOA評(píng)分由術(shù)前的6.7±1.6分提高至術(shù)后1周時(shí)的8.9±2.2分、1個(gè)月時(shí)的10.6±2.5分、3個(gè)月時(shí)的12.0±2.8分、6個(gè)月時(shí)的13.9±3

12、.1分和末次隨訪時(shí)的14.5±3.6分，手術(shù)前后比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），神經(jīng)功能改善率為70.2%±10.3%。末次隨訪時(shí)根據(jù)ASIA分級(jí)：A組獲A級(jí)3例，B級(jí)7例， C級(jí)10例，D級(jí)14例，E級(jí)4例；B組獲A級(jí)3例，B級(jí)6例，C級(jí)16例，D級(jí)17例，E級(jí)12例，兩組與治療前比較均具有顯著性差異（P<0.05）。A組發(fā)生消化道出血1例，肺部感染2例，褥瘡2例，下肢深靜脈血栓1例；B組發(fā)生傷口感染1例，硬膜外血腫2例，褥瘡

13、1例，硬膜撕裂導(dǎo)致腦脊液漏1例，兩組并發(fā)癥發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：與非手術(shù)方法相比，脊髓減壓內(nèi)固定術(shù)可更快、更好的促進(jìn)無骨折脫位型脊髓損傷患者神經(jīng)功能的恢復(fù)，且手術(shù)治療不會(huì)增加圍手術(shù)期并發(fā)癥的發(fā)生率。
　　第三部分：前、后路減壓內(nèi)固定術(shù)治療無骨折脫位型脊髓損傷療效對(duì)比分析
　　目的：目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)通過不同方法和側(cè)面比較均已證實(shí)無骨折脫位型脊髓損傷（CSCIWFD）手術(shù)治療效果要明顯優(yōu)于各

14、種非手術(shù)療法。因此，臨床上一旦遇到CSCIWFD患者出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能受損時(shí)，就需要采取積極的、合適的手術(shù)入路及減壓方法來重建或恢復(fù)椎管的通暢性。
　　用于治療CSCIWFD的手術(shù)方法很多，常見的有頸椎前路椎間盤摘除植骨內(nèi)固定術(shù)、頸前路椎體次全切除植骨內(nèi)固定術(shù)、頸后路單開門椎管擴(kuò)大成形內(nèi)固定術(shù)、頸后路全椎板減壓側(cè)塊螺釘內(nèi)固定術(shù)等。根據(jù)手術(shù)入路劃分，上述術(shù)式可分為經(jīng)前路和后路脊髓減壓術(shù)，那么前、后路手術(shù)在總體療效上是否存在差異呢

15、，本研究針對(duì)這一問題進(jìn)行了分組比較。
　　方法：回顧性分析2013年09月～2015年12月在我院接受手術(shù)治療的82例CSCIWFD患者的臨床資料，根據(jù)患者接受的是前路減壓還是后路減壓將其分為兩組：A組（前路組），45例，其中男26例，女19例，年齡22～62歲，平均41.6歲，均接受頸前路減壓內(nèi)固定術(shù)治療；B組（后路組），37例，其中男24例，女13例，年齡19～64歲，平均42.9歲，均接受頸后路減壓內(nèi)固定術(shù)治療。分別記錄兩組

16、患者的手術(shù)時(shí)間、術(shù)中出血量及并發(fā)癥發(fā)生情況；術(shù)前及隨訪過程中以日本骨科協(xié)會(huì)（Japanese Orthopaedic Association, JOA）脊髓損害評(píng)分表（17分法）評(píng)估治療效果；末次隨訪時(shí)根據(jù)ASIA脊髓損傷分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)兩組患者神經(jīng)功能恢復(fù)恢復(fù)情況進(jìn)行比較分析。
　　結(jié)果：兩組患者均順利接受手術(shù)，A組平均手術(shù)時(shí)間（62.6±13.7） min，平均出血量（105.1±16.3）ml；B組手術(shù)時(shí)間（117.9±22.6）

17、 min，術(shù)中出血量（240.8±46.3）ml，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。A組JOA評(píng)分由治療前的6.8±1.5分提高至術(shù)后2周時(shí)9.5±1.9分、3個(gè)月時(shí)的11.6±2.6分及末次隨訪時(shí)的13.5±3.1分，治療前后比較差異具有顯著性（P<0.05），神經(jīng)功能改善率為65.6%±8.3%，手術(shù)前后比較差異具有顯著性（P<0.05）；B組JOA評(píng)分由術(shù)前的6.6±1.4分提高至術(shù)后2周時(shí)8.6±1.7分、術(shù)后3個(gè)月時(shí)

18、的10.9±2.5分及末次隨訪時(shí)的13.3±3.4分，手術(shù)前后比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），神經(jīng)功能改善率為64.5%±8.5%。術(shù)后2周時(shí)兩組JOA評(píng)分比較具有顯著性差異（P<0.05）。但術(shù)后3個(gè)月及末次隨訪時(shí)兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。末次隨訪時(shí)根據(jù)ASIA分級(jí)：A組獲A級(jí)1例，B級(jí)6例，C級(jí)11例，D級(jí)18例，E級(jí)9例；B組獲A級(jí)1例，B級(jí)4例，C級(jí)11例，D級(jí)13例，E級(jí)8例，與治療前比較均具有顯著性

19、差異（P<0.05），術(shù)后組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。A組發(fā)生腦脊液漏2例，喉返神經(jīng)牽拉損傷1例；鈦網(wǎng)下沉1例；B組發(fā)生傷口感染1例，液化壞死1例，硬膜外血腫2例，兩組并發(fā)癥發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：經(jīng)前路和后路脊髓減壓內(nèi)固定術(shù)均可以有效促進(jìn)患者神經(jīng)功能的恢復(fù)，圍手術(shù)期并發(fā)癥的發(fā)生率基本相同，但頸前路手術(shù)創(chuàng)傷小，手術(shù)時(shí)間短，術(shù)中出血少，術(shù)前應(yīng)根據(jù)患者脊髓受壓節(jié)段、壓迫源及髓內(nèi)信號(hào)長(zhǎng)度來進(jìn)