小鼠Map2k6基因區(qū)域三個片段的敲除.pdf

1、目的：
　　 基因敲除技術(shù)(Gene Knockout)是一種新型分子生物學(xué)技術(shù),是利用DNA同源重組使細(xì)胞中特定的基因失活或缺失的技術(shù)。該技術(shù)自上世紀(jì)80年代末誕生以來,已被廣泛應(yīng)用于功能基因組學(xué)等研究領(lǐng)域。由于小鼠基因組與人類基因組具有高度相似性,通過該技術(shù)構(gòu)建出來的基因敲除小鼠模型已成為研究人類疾病強(qiáng)有力的工具和手段。
　　 先天性全身終毛增多癥(Congenital Generalized Hypertricho

2、sis Terminalis,CGHT,MIM ID＃135400)是一種非常罕見的人類疾病,俗稱“狼人綜合征”(Werewolf Syndrome)。其特點(diǎn)是非雄激素依賴性全身性毛發(fā)過度生長,常伴發(fā)牙齦增生和面部特征畸形,且不受性別、年齡和種族限制,曾一度被認(rèn)為是一種返祖現(xiàn)象(Atavism)。2009年,本課題組在國際上首次確定人類染色體17q24.2-q24.3區(qū)域拷貝數(shù)變異(Copy Number Variation,CNV)對

3、CGHT發(fā)生起到?jīng)Q定性作用,并提出該區(qū)域內(nèi)的Map2k6等4個蛋白編碼基因為CGHT的致病候選基因,但該病發(fā)生的具體分子機(jī)制仍不甚明了,而且病例少、病理組織取材困難等限制無疑又進(jìn)一步增加了研究的難度。
　　 作為CGHT致病主要候選基因之一的Map2k6基因,負(fù)責(zé)編碼促分裂原活化蛋白激酶激酶蛋白。但據(jù)文獻(xiàn)報道,一名包含有Map2k6基因在內(nèi)的染色體17q24.2-q24.3區(qū)域微缺失的病人并沒有出現(xiàn)CGHT相關(guān)的疾病特征。并且,

4、Map2k6基因敲除小鼠模型同樣也沒有表現(xiàn)出明顯的毛發(fā)生長方面的異常。但值得注意的是,目前構(gòu)建的Map2k6基因敲除模型主要是敲除該基因的編碼序列以破壞其蛋白表達(dá),而針對該基因區(qū)域潛在調(diào)控相關(guān)元件的研究甚少。小鼠的Map2k6基因位于染色體11qE2區(qū)域,通過比較基因組學(xué)研究我們發(fā)現(xiàn),該基因區(qū)域染色體位置110,260,185-110,264,752和110,362,441-110,367,890(UCSC數(shù)據(jù)庫July2007,NCB

5、I37/mm9)各有一段保守的區(qū)域,并且其3'非編碼區(qū)染色體位置110,378,469-110,387,006有一段表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tags,EST)集中的區(qū)域,而此類區(qū)域常被認(rèn)為具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和翻譯等重要的功能。
　　 本課題旨在針對上述三個DNA片段分別構(gòu)建基因打靶載體,并用于產(chǎn)生基因敲除小鼠胚胎干細(xì)胞克隆,進(jìn)而生成相應(yīng)的基因敲除小鼠模型。該敲除模型的建立將有助于了解Map2k6基因本身

6、及其對鄰近基因表達(dá)可能存在的調(diào)控模式,進(jìn)而為將來最終闡明CGHT的具體分子發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1、對小鼠Map2k6基因區(qū)域進(jìn)行比較基因組學(xué)分析,確定該基因的5'非翻譯區(qū)(Untranslated Region,UTR)至內(nèi)含子1、內(nèi)含子10以及3'非編碼區(qū)三段敲除區(qū)域,即染色體11qE2位置110,260,185-110,264,752、110,362,441-110,367,890、110,378

7、,469-110,387,006(UCSC數(shù)據(jù)庫July2007,NCBI37/mm9),大小分別為4,568 bp、5,450 bp、8,538 bp,并在理論上設(shè)計針對上述三個區(qū)域的置換型基因打靶載體。
　　 2、以覆蓋以上區(qū)域的BAC克隆DNA為模板,利用PCR分別擴(kuò)增三個打靶載體對應(yīng)的六段同源臂序列,并按照理論設(shè)計的先后順序分別在基因敲除通用載體pL452骨架上安裝每個打靶載體兩側(cè)的同源臂,最終通過測序確認(rèn)打靶載體的序列

8、信息正確。
　　 3、復(fù)蘇小鼠胚胎干細(xì)胞系A(chǔ)B2.2和JMSA3,并培養(yǎng)調(diào)整到良好的生長狀態(tài),取部分細(xì)胞做囊胚注射來驗證其多能性(Pluripoteney)。然后,利用電穿孔(Electroporation)的方法將線性化的三個基因打靶載體分別導(dǎo)入AB2.2和JM8A3中,在G418藥物篩選后,挑選存活下來并具有良好細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞克隆進(jìn)行培養(yǎng)、增殖和保存。最后,提取這些細(xì)胞克隆的基因組DNA,利用PCR和SouthernBlot

9、的方法從中鑒定出正確的基因敲除細(xì)胞克隆。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功構(gòu)建針對小鼠Map2k6基因區(qū)域、染色體11qE2區(qū)位置110,260,185-110,264,752、110,362,441-110,367,890、110,378,469-110,387,006,大小分別為4,568 bp、5,450 bp、8,538 bp的三個置換型基因打靶載體(分別命名為KO-1、KO-2和KO-3),其線性化后長度分別為14

10、,585 bp、14,110 bp、12,630 bp,并均已測序確認(rèn)。
　　 2、將線性化的三個打靶載體導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞系A(chǔ)B2.2和JM8A3中,經(jīng)G418藥物選擇后,AB2.2分別生長出202、76、107個克隆,從中挑取96、44、48個克隆進(jìn)行培養(yǎng)鑒定;JM8A3分別生長出305、176、193個克隆,從其中挑取180、129、156個克隆進(jìn)行培養(yǎng)鑒定。目前,已獲得7個KO-1基因敲除的JM8A3細(xì)胞克隆;KO-2和

11、KO-3經(jīng)過PCR初步篩選也分別得到了30和36個可能為同源重組陽性的ES細(xì)胞克隆,有待進(jìn)一步鑒定。
　　 結(jié)論：
　　 本研究經(jīng)初步鑒定獲得了小鼠Map2k6基因區(qū)域三個片段,即染色體11qE2區(qū)位置110,260,185-110,264,752、110,362,441-110,367,890、110,378,469-110,387,006的DNA序列,被靶向敲除的三種小鼠胚胎干細(xì)胞系,并用于建立相應(yīng)區(qū)域的“基因敲除”