Map2k6基因座內(nèi)三個(gè)片段的敲除小鼠的制備.pdf

1、第一部分 Map2k6基因座內(nèi)三個(gè)片段敲除小鼠的制備
　　 基因打靶(gene targeting)是20世紀(jì)80年代興起的分子生物學(xué)技術(shù)，其基本原理是將外源DNA序列導(dǎo)入靶細(xì)胞，利用同源重組將外源DNA序列定點(diǎn)整合到靶細(xì)胞基因組中?；虼虬凶鳛樾滦偷幕虿僮骷夹g(shù)，主要應(yīng)用于基因功能研究及遺傳病基因治療等方面。
　　 先天性全身性終毛增多癥(Congenital Generalized Hypertrichosis Te

2、rminalis，CGHT，MIM ID:135400)是一種極為罕見(jiàn)的遺傳病，其發(fā)病特點(diǎn)為不依賴雄性激素的全身性毛發(fā)過(guò)度生長(zhǎng)，且不受年齡，種族及性別影響，因此該病又稱“狼人綜合征”，曾一度被認(rèn)為是人類“返祖現(xiàn)象”(Atavism)。該病致病機(jī)理一直不清楚，直至2009年本課題組將CGHT致病區(qū)域定位于17q24.2-q24.3，該區(qū)域的拷貝數(shù)變異(Copy Number Variation，CNV)在該病中起決定性作用，并提出包括Ma

3、p2k6等在內(nèi)的四個(gè)基因可能為CGHT的致病基因。然而，CGHT作為一種極為罕見(jiàn)的遺傳病，發(fā)病率低，加上該病的高度遺傳異質(zhì)性，其具體致病機(jī)理研究仍存在較大困難。
　　 CGHT致病區(qū)域包含四個(gè)蛋白編碼基因，分別為ABCA5(MIM612503)，ABCA6(MIM612504)，ABCA10(MIM612508)和MAP2K6。而有文獻(xiàn)報(bào)道，在正常漢族人群中ABCA5，ABCA6, ABCA10三個(gè)基因缺失卻未發(fā)病，從而使MAP

4、2K6基因成為CGHT的候選基因。MAP2K基因主要編碼蛋白為絲裂原活化蛋白激酶激酶6，該基因突變會(huì)導(dǎo)致一系列類似于CGHT患者的面部特征，但未出現(xiàn)毛發(fā)過(guò)度生長(zhǎng)這一主要表型，而且Map2k6的基因敲除小鼠也沒(méi)有CGHT表型。然而，已有的Map2k6基因敲除小鼠一般都是將該基因的編碼序列敲除，而很少對(duì)其潛在的調(diào)控區(qū)進(jìn)行研究。而近年隨著非編碼區(qū)(noncoding region)慢慢被人們重視，非編碼區(qū)在維持染色體結(jié)構(gòu)和功能、基因表達(dá)調(diào)控、

5、著絲粒以及有絲分裂中同源序列的識(shí)別上可能有重要功能。因此我們的思路是通過(guò)小鼠模型來(lái)研究Map2k基因座的非編碼序列是否是導(dǎo)致CGHT的發(fā)病原因。Map2k6基因位于小鼠11號(hào)染色體上，通過(guò)比較基因組學(xué)研究，我們發(fā)現(xiàn)該基因座存在兩段非常保守的區(qū)域和一段表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Taq，EST)富集區(qū)，而這類區(qū)域一般在基因表達(dá)調(diào)控上發(fā)揮著重要功能。
　　 本課題旨在利用三個(gè)已構(gòu)建好的打靶載體分別轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)

6、胞，產(chǎn)生相應(yīng)的基因打靶胚胎干細(xì)胞克隆，進(jìn)而制備Map2k6的基因敲除小鼠。并以此為研究對(duì)象對(duì)Map2k6基因座內(nèi)非編碼序列與CGHT的潛在關(guān)系進(jìn)行研究，并期望揭示CGHT發(fā)病機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、大量制備并純化已構(gòu)建好的三個(gè)打靶載體(KO-1，KO-2，KO-3)，將它們線性化后分別電穿孔轉(zhuǎn)染狀態(tài)良好且未分化的C57BL/6N背景的小鼠ES細(xì)胞株JM8A3，經(jīng)過(guò)藥物篩選后得到一定數(shù)目的藥物抗性ES細(xì)胞克隆，并通

7、過(guò)PCR初步鑒定發(fā)生同源重組的陽(yáng)性細(xì)胞克隆;
　　 2、通過(guò)Southern blot進(jìn)一步鑒定同源重組陽(yáng)性細(xì)胞克隆，然后對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行中期染色體制備，通過(guò)染色體計(jì)數(shù)挑選出二倍體百分率較高的克隆進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);
　　 3、對(duì)Southern blot鑒定陽(yáng)性且二倍體百分率較高的細(xì)胞克隆進(jìn)行相關(guān)多能性鑒定，將具有較高多能性的陽(yáng)性克隆培養(yǎng)到良好狀態(tài)后進(jìn)行囊胚注射，然后將囊胚移植到假孕鼠子宮中，最終獲得嵌合體小鼠;
　　

8、 4、將6-8周的嵌合體小鼠與野生型C57小鼠交配，進(jìn)行突變基因種系傳遞驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功將線性化的三個(gè)打靶載體分別導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞JM8A3中，經(jīng)過(guò)藥物篩選后獲得一定數(shù)目的藥物抗性克隆，并對(duì)部分克隆進(jìn)行了PCR初步鑒定。
　　 目前，已獲得3株KO-1同源重組陽(yáng)性細(xì)胞克隆，16株KO-2隨機(jī)整合陰性細(xì)胞克隆及2株KO-3同源重組陽(yáng)性細(xì)胞克隆;
　　 2、對(duì)3株KO-1同源重組陽(yáng)性克隆

9、進(jìn)行Southern blot驗(yàn)證，并對(duì)其進(jìn)行中期染色體制備，統(tǒng)計(jì)這三株克隆二倍體百分率，結(jié)果提示該三株克隆染色體條數(shù)正常，適合做囊胚注射;
　　 3、對(duì)3株KO-1細(xì)胞克隆進(jìn)行多能性評(píng)估，結(jié)果提示它們均具備良好的多能性。將這3株克隆進(jìn)行囊胚注射，共獲得4只嵌合體小鼠，其中一只因發(fā)育異常出生后不久死亡，另3只狀態(tài)良好。目前正在對(duì)這三只小鼠進(jìn)行突變基因種系傳遞實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)論：
　　 本課題已獲得KO-1， KO

10、-3靶向敲除陽(yáng)性ES細(xì)胞克隆，并通過(guò)囊胚注射獲得KO-1嵌合體小鼠;KO-2也獲得一定數(shù)量克隆，并通過(guò)初步鑒定可能為靶向敲除陽(yáng)性克隆。
　　 第二部分色素異常遺傳病致病基因突變分析
　　 非綜合征色素異常遺傳病是一類由于黑色素合成異常導(dǎo)致的皮膚色素病變，患者主要表現(xiàn)為色素減退、沉著或毛發(fā)色素減退。此類疾病主要包括遺傳性對(duì)稱性色素異常癥，白化病，斑駁病，白癜風(fēng)等。
　　 遺傳性對(duì)稱性色素異常(dyschromato

11、sis symmetrica of hereditaria, DSH，OMIM27400)是一種較少見(jiàn)的常染色體顯性遺傳病，患者主要臨床表現(xiàn)為手足背側(cè)的對(duì)稱性的色素沉著斑或減退斑，一般嬰幼兒時(shí)期開(kāi)始發(fā)病。該病在中國(guó)和日本較多見(jiàn)，ADAR基因?yàn)镈SH的主要致病基因。本研究在我們收集到的一個(gè)DSH家系中，通過(guò)PCR對(duì)患者ADAR基因外顯子，及外顯子/內(nèi)含子銜接區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了ADAR基因外顯子4存在錯(cuò)義突變:c.183

12、4G＞A，導(dǎo)致該基因編碼蛋白第612位甘氨酸被精氨酸取代(p.G612R)，迄今國(guó)內(nèi)外尚無(wú)該突變的報(bào)道。我們?cè)诨颊呒蚁岛驼Ｈ巳褐羞M(jìn)行突變致病性驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)家系中所有兩名患者均攜帶該突變，而在正常人中不存在?？傊?，我們?cè)贏DAR基因中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)DSH致病新突變(c.1834G＞A p.G612R)，進(jìn)一步豐富了ADAR基因突變譜。
　　 白化病(albinism)是一種較常見(jiàn)的由黑色素缺乏引起的隱性遺傳病。主要表現(xiàn)為皮膚，毛發(fā)和（

13、或）眼部色素減少，大部分患者還會(huì)出現(xiàn)斜視，畏光，眼球震顫等癥狀。白化病具有較強(qiáng)的遺傳異質(zhì)性，目前主要分為非綜合征白發(fā)病和綜合征白化病，非綜合征白發(fā)病主要包括四種類型:Ⅰ-Ⅲ型均為眼皮膚白化病，共同表現(xiàn)為毛發(fā)、皮膚及眼部色素減少。三者主要區(qū)別是:OCA1最為常見(jiàn)，致病基因?yàn)門YR基因; OCA2臨床表現(xiàn)跟OCA1類似，但OCA2病人會(huì)隨年齡增長(zhǎng)色素少量增加，致病基因?yàn)镻基因;OCA3患者表現(xiàn)銅紅色皮膚和毛發(fā)，致病基因?yàn)門YRP1;另外一種

14、白化病為眼白化病(OA)，為X連鎖遺傳，患者僅眼部出現(xiàn)色素減少，致病基因?yàn)镺A1基因。本研究收集到3個(gè)典型白化病家系，對(duì)先證者TYR基因外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界處進(jìn)行PCR-測(cè)序，發(fā)現(xiàn)三家系均存在TYR基因突變:家系1突變?yōu)閏.896G＞A（p.R299H）/C.1038-11_-7delTTAATinsAAA;家系2突變?yōu)閏.896G＞A(p.R299H)/c.1199G＞T(p.W400L);家系3突變?yōu)閏.929_930insC

15、(p.R311fsX317)/C.1038-11_-7delTTAATinsAAA。上述突變?cè)趪?guó)外文獻(xiàn)中均有報(bào)道，我們?cè)俅卧谥袊?guó)人群中證實(shí)了其致病性。
　　 斑駁病(piebaldism)是一種先天性常染色體顯性遺傳病?；颊咧饕憩F(xiàn)為頭、額及軀干和四肢出現(xiàn)不規(guī)則的白斑，合并白色毛發(fā)，也有人稱之為部分白化病。本研究收集1例斑駁病散發(fā)病例，提取患者外周血總RNA，通過(guò)RT-PCR和基因測(cè)序，對(duì)其KIT基因進(jìn)行序列分析。測(cè)序結(jié)果表明患