5-Aza-dC及TSA對胃癌細胞系中P16和hMLH-1基因甲基化水平及表達的影響.pdf

1、目的： 近來，在腫瘤學研究發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)高甲基化異常是導致許多腫瘤抑制基因表達異常的內(nèi)在機制，癌基因的激活和抑癌基因的失活為其中兩個重要的分子事件。目前，普遍認為DNA甲基化除缺失與突變之外導致基因失活的第三種機制，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著不可忽視的作用。由于高甲基化而不表達的抑癌基因，如果能應(yīng)用去甲基化制劑逆轉(zhuǎn)甲基化異常狀態(tài)，使之重新表達，理論上即可發(fā)揮起抑制腫瘤生長的功能。 胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，在我國局各類惡

2、性腫瘤之首。近年來，早期胃癌術(shù)后5年生存率已有很大提高，但進展期胃癌術(shù)后5年生存率一直沒有進一步提高。研究表明，胃癌發(fā)生發(fā)展是一個多基因參與的多階段的過程。 本實驗采用甲基化特異性PCR(MSP)及反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法探討5-Aza-dC及TSA對胃癌細胞系中抑癌基因P16和hMLH-1基因甲基化水平和基因表達的影響。本實驗為闡明細胞增殖、分化、癌變過程提供線索，并且可能為腫瘤的臨床診斷、治療、預后提供實驗依據(jù)。

3、 方法： 1、胃癌細胞系培養(yǎng)及5-Aza-dC、TSA干預：細胞接種于含10 mL/L小牛血清(56℃滅活30 min)、100×103U/L青霉素及100×103U/L鏈霉素的pH7.2的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、含5％CO2的濕潤空氣的恒溫密閉式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分成四組，分別應(yīng)用5-Aza-dC及TSA干預。(1)加5μmol/L 5-aza-dC培養(yǎng)72小時；(2)加TSA300nmol/L培養(yǎng)24小時；(3)

4、加5μmol/L 5-Aza-dC培養(yǎng)48小時后加TSA300nmol/L繼續(xù)培養(yǎng)24小時。 2、標本的抽提：采用酚/氯仿法抽提基因組DNA，用TRIZOL試劑提取總RNA。 3、甲基化特異性PCR：先用亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA，純化DNA后使用P16、hMLH-1基因甲基化及非甲基化引物同時進行擴增。 4、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)：先將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以P16、hMLH-1基因引物進行PCR

5、擴增，同時以GAPDH為內(nèi)參。 5、PCR產(chǎn)物的檢測：PCR擴增產(chǎn)物2％瓊脂糖凝膠電泳，采用FluorChen V.2.0軟件，對圖像中的擴增產(chǎn)物條帶進行光密度分析，實驗重復三次。 結(jié)果： 1、胃癌細胞系MKN-45和MGC-803均顯示P16、hMLH-1基因啟動子區(qū)存在高甲基化，其中P16基因在兩種胃癌細胞系中均表現(xiàn)為甲基化，hMLH-1基因在胃癌細胞系MGC-803中表現(xiàn)為甲基化而在胃癌細胞系MKN-45中

6、表現(xiàn)為半甲基化。 2、MKN-45和MGC-803細胞系經(jīng)TSA，5-Aza-dC及聯(lián)合作用后使原來不表達或有弱表達的抑癌基因P16和hMLH-1重新表達或表達增強。 3、在5-Aza-dC及TSA的作用下，MKN-45和MGC-803細胞系中P16及hMLH-1基因的甲基化狀態(tài)得到了逆轉(zhuǎn)。 結(jié)論： P16及hMLH-1基因的異常甲基化是胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的頻繁事件。胃癌細胞系中抑癌基因P16和hMLH