TNFα調(diào)節(jié)SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞KLF4表達(dá)及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：從世界范圍來看,在乳腺所發(fā)生的各種類型病變中乳腺癌是主要的致死原因,其發(fā)病率正逐年升高,現(xiàn)在在女性各種惡性腫瘤中已經(jīng)排名第一位,并逐漸向年輕化發(fā)展,而且越是年輕的患者,其乳腺癌的病理類型往往提示侵襲性越高,預(yù)后也越差。因此,進(jìn)一步深入的理解和研究乳腺癌的發(fā)生以及發(fā)展機(jī)理,對如何早期發(fā)現(xiàn)以及減少乳腺癌的發(fā)病率相關(guān)因素的影響,進(jìn)而對提高乳腺癌患者的生存率、改善生活質(zhì)量和降低發(fā)病率具有十分重要的意義。近年來大量研究表明乳腺癌的發(fā)生以及發(fā)

2、展是多個基因共同起作用,經(jīng)過多個步驟逐步導(dǎo)致的結(jié)果。盡管近年來乳腺癌的發(fā)病率不斷增加,但是隨著分子生物技術(shù)的進(jìn)展以及分子標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)等診療技術(shù)的進(jìn)步,都為乳腺癌有效的靶向治療提供了更多的可能性,因此對乳腺癌發(fā)生有關(guān)的易感基因及其相關(guān)基因產(chǎn)物的研究逐漸成為腫瘤學(xué)關(guān)注和深入探索的焦點問題,引起了眾多學(xué)者的極大興趣,同時也取得了很大成就。KLF(Krüppel-likefactor)家族是真核生物中一大類基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子(basictranscr

3、iptionelement-bindingprotein,BTEB),是黑腹果蠅中含有鋅指結(jié)構(gòu)的一種具有特征性的轉(zhuǎn)錄因子,大量哺乳動物基因的DNA結(jié)合域都包含有類似的結(jié)構(gòu),因此與Krüppel均具有序列同源性。在結(jié)構(gòu)上,和20世紀(jì)80年代早期發(fā)現(xiàn)的Sp1蛋白因子(specificprotein1)家族具有高度的相似性,都具備一個由3個串聯(lián)富含GC/GT的Cys2His2組成的羧基端,至少由16個各異的成分組成,并且根據(jù)該結(jié)構(gòu),我們可以劃

4、分出幾個不同的亞型,在細(xì)胞分化、增殖、凋亡、血管的生成以及胚胎形成過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用,同時很可能與乳腺癌的惡性程度、發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的幾率以及患者預(yù)后有十分密切的關(guān)系,是一種最重要的真核生物中的基礎(chǔ)調(diào)控因子。KLF4(Krüppel-likefactors4)是KLF家族的成員之一,在多種細(xì)胞的生長、增殖、分化及細(xì)胞重編程等多種生物學(xué)過程執(zhí)行著重要功能,與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸有關(guān)。KLF4在特定的組織中以細(xì)胞依賴的方式發(fā)揮抑

5、癌作用或者致癌作用,在早期腸腺瘤、結(jié)腸腺瘤以及直腸、食管、膀胱、前列腺、頭頸部等多種惡性腫瘤中均經(jīng)研究證實存在著KLF4的表達(dá)量以及表達(dá)方式的改變。然而,KLF4表達(dá)下調(diào)并不一定發(fā)生在所有類型和組織來源的腫瘤中,例如在口腔癌中KLF4的特點卻是表達(dá)量的增加,并且它在腫瘤細(xì)胞中的定位與腫瘤的侵襲性以及惡性程度緊密相聯(lián)。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及生物學(xué)行為是在多個分子信號通路的調(diào)控下發(fā)生的,而轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控這些通路的過程中充當(dāng)了重要角色,有研究表

6、明乳腺癌與真核鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子中關(guān)系最密切的是KLF4(即胃腸富集因子Krüppel樣因子),然而目前現(xiàn)有的有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子KLF4與乳腺癌之間關(guān)系的研究報道尚存在很大的爭議。因此,研究在乳腺癌中轉(zhuǎn)錄因子KLF4的表達(dá)變化情況和趨勢,這些變化對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為以及患者的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸帶來的影響,在乳腺癌形成過程中所發(fā)揮的作用以及分子機(jī)制,對進(jìn)一步認(rèn)識乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、分級、分期、及早發(fā)現(xiàn)以及臨床治療等眾多方面都具有極其深遠(yuǎn)的影響。本課題通

7、過采用(1)Westernblot檢測不同濃度及不同時間TNFα刺激下乳腺癌細(xì)胞中KLF4蛋白的表達(dá)情況;(2)采用流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)檢測刺激因子作用下乳腺癌細(xì)胞的周期以及凋亡的情況;(3)腺病毒載體介導(dǎo)KLF4過表達(dá),采用DAPI染色技術(shù)檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡程度。旨在從細(xì)胞、分子水平上分析乳腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子KLF4的表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)性,為更有效的治療乳腺癌提供新的靶點。
　　方法：采用不同濃度TNFα(0、1、5、10

8、、20ng/mL)相同作用時間(24小時)以及相同濃度(10ng/mL)不同時間(0、6、12、24、34小時)刺激SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞,提取蛋白后應(yīng)用Western印跡分析的方法檢測KLF4的表達(dá)水平;應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和DAPI染色的方法分析不同濃度以及不同時間刺激因子作用下對乳腺癌細(xì)胞的作用以及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后乳腺癌細(xì)胞的凋亡情況,并對比加入刺激因子前后乳腺癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變以及凋亡情況。應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理,所有數(shù)據(jù)以

9、均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S.D.)表示。均數(shù)比較采用t檢驗或單因素方差分析(One-wayANOVA),以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：不同濃度TNFα(0、1、5、10、20ng/mL)刺激SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞24小時后,隨著刺激濃度的增高,KLF4表達(dá)水平呈劑量依賴性逐漸增多;相同濃度(10ng/mL)不同時間TNFα(0、6、12、24、34小時)作用下的結(jié)果顯示,隨著對乳腺癌細(xì)胞刺激時間的增加,KLF4的表達(dá)水

10、平以時間依賴性的方式逐漸遞增;流式細(xì)胞術(shù)和DAPI染色顯示,TNFα可以誘導(dǎo)SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞的凋亡,并且隨著刺激劑量和時間的增加,細(xì)胞核固縮程度顯著加重,細(xì)胞凋亡程度明顯提高;構(gòu)建pAd-EGFP和pAd-EGFP-KLF4腺病毒表達(dá)載體,在SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)EGFP或EGFP-KLF4,再給予TNFα刺激后,DAPI染色和流式細(xì)胞術(shù)觀察結(jié)果經(jīng)對比顯示,KLF4過表達(dá)之后乳腺癌細(xì)胞核固縮程度較大,而且可以明顯促進(jìn)S