抗HIF-1α肺腺癌人源單鏈抗體制備及在荷人肺腺癌裸鼠體內(nèi)的放射免疫顯像.pdf

1、肺癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，80％以上都屬非小細(xì)胞肺癌，肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌中非常重要的一種病理類(lèi)型。目前肺癌的發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)的勢(shì)頭，而且大部分肺癌患者確診時(shí)已發(fā)展到了中晚期，因此對(duì)人類(lèi)的健康有著很?chē)?yán)重的威脅。由于肺癌早期不容易診斷，主要治療手段如手術(shù)、化學(xué)藥物治療、外放療對(duì)肺癌的有效率又不是很理想，而且還有諸多不良反應(yīng)，所以肺癌的早期診斷和治療急須研究出新的有效途徑。目前，放免顯像和放免治療成為國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者爭(zhēng)相研究的熱點(diǎn)。將放射性核

2、素標(biāo)記特異性的抗體，通過(guò)抗原-抗體免疫反應(yīng)機(jī)制導(dǎo)向性地將放射性核素引入體內(nèi)，一方面利用外部的放射性探測(cè)設(shè)備對(duì)疾病進(jìn)行診斷，另一方面放射性核素可以釋放射線(xiàn)來(lái)對(duì)病變組織進(jìn)行破壞，起到治療的作用。放免顯像和放免治療已成為生物治療領(lǐng)域的一個(gè)很重要的方向，在腫瘤的早期診斷、正確分期、有效治療方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。
　　 選擇好的靶點(diǎn)，制備出特異性的抗體是放免顯像及治療的關(guān)鍵。缺氧誘導(dǎo)因子1是腫瘤缺氧時(shí)發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，HI

3、F-1α是其主要功能亞基。很多研究證實(shí)HIF-1α在非小細(xì)胞肺癌腫瘤中高表達(dá)，而且與腫瘤組織的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移都密切相關(guān)，有可能成為肺癌診斷和治療的新的有效靶點(diǎn)。在抗體的選擇上，噬菌體單鏈抗體摒棄了單克隆抗體的人抗鼠抗體反應(yīng)，是完全的人源性抗體，同時(shí)相對(duì)分子量小、穿透力好、免疫原性弱、易清除，比單克隆抗體有更大的優(yōu)勢(shì)，有望在臨床上得到更廣泛的應(yīng)用。
　　 為了找到有效的肺癌診斷、治療的新方法，我們嘗試從大容量噬菌體抗體庫(kù)中篩選出

4、特異抗HIF-1α的肺腺癌人源單鏈抗體，經(jīng)放射性核素標(biāo)記后進(jìn)行荷人肺腺癌裸鼠體內(nèi)的放射免疫顯像。
　　 目的：采用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)制備抗HIF-1α肺腺癌人源單鏈抗體，行荷人肺腺癌裸鼠體內(nèi)的放射免疫顯像研究，為肺癌的免疫顯像和治療提供一條新的有效方法。
　　 方法與結(jié)果：
　　 第一部分抗HIF-1α肺腺癌人源單鏈抗體的制備
　　 1.肺腺癌A549細(xì)胞、HIF-1α對(duì)噬菌體抗體庫(kù)的篩選：正常支氣管上皮細(xì)

5、胞HBE16吸附后，以肺腺癌A549細(xì)胞、HIF-1α為抗原對(duì)噬菌體抗體庫(kù)分別進(jìn)行4輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”富集篩選，噬菌體回收率逐漸提高，最后一輪產(chǎn)出為5.9×105 cfu/ml，噬菌體抗體得到了富集。
　　 2.ELISA、免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定噬菌體抗體：挑取單菌落制備噬菌體抗體，ELISA檢測(cè)10個(gè)中有5個(gè)與HIF-1α抗原反應(yīng)呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為50％。免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定顯示篩選出的噬菌體抗體使肺腺癌A549細(xì)胞明顯深染，證實(shí)此抗

6、體與肺腺癌A549細(xì)胞特異結(jié)合，卻不與乳腺癌MDA-MB-435s細(xì)胞結(jié)合。
　　 3.可溶性抗HIF-1α單鏈抗體的表達(dá)、純化：將ELISA鑒定強(qiáng)陽(yáng)性的重組噬菌體感染E.coli HB2151，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行可溶scFv的表達(dá)。用SDS-PAGE鑒定出scFv成功可溶表達(dá)的菌液，并過(guò)HiTrapTMAnti-E Tag柱純化。純化可溶scFv經(jīng)Western-blot鑒定，進(jìn)一步證明scFv的可溶表達(dá)和純化的成功，且測(cè)定可

7、溶scFv相對(duì)分子量在30kDa左右。
　　 4.ELISA鑒定可溶scFv的免疫活性：ELISA顯示肺腺癌細(xì)胞A549的D（450）為0.61±0.08，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435s的D（450）為0.30±0.06.正常支氣管上皮細(xì)胞HBE16的D（450）為0.29±0.07，證明可溶scFv具備較高的免疫活性，與肺癌細(xì)胞A549結(jié)合，而不與乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435s、正常支氣管上皮細(xì)胞HBE16結(jié)合。競(jìng)爭(zhēng)抑制E

8、LISA顯示可溶scFv與游離的HIF-1α產(chǎn)生抑制效應(yīng)，效應(yīng)與游離HIF-1α的劑量相關(guān)，證明可溶scFv與HIF-1α有較高結(jié)合活性。
　　 第二部分131Ⅰ-可溶scFv在荷人肺腺癌裸鼠體內(nèi)的放射免疫顯像和圖像融合
　　 1.抗HIF-1α可溶scFv的放射性核素標(biāo)記、純化及鑒定：采用氯胺T法對(duì)制備的抗HIF-1α可溶scFv進(jìn)行131Ⅰ標(biāo)記，標(biāo)記液過(guò)SephadexG200柱純化。三氯醋酸沉淀法測(cè)131Ⅰ-可溶s

9、cFv的標(biāo)記率為79.6±4.9％，紙層析法分析放射化學(xué)純度為94.4±4.4％，放射性比活度為3.2±0.2MBq/μg，室溫放置24h和新鮮人血清中孵育48h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的放射化學(xué)純度均在90％以上。
　　 2.放射免疫顯像和圖像融合：建立荷人肺腺癌裸鼠模型，注射131Ⅰ-可溶scFv，SPECT下行平面靜態(tài)顯像，ROI技術(shù)測(cè)定T/NT（腫瘤與非腫瘤區(qū)放射性計(jì)數(shù)比值），結(jié)果顯示裸鼠腫瘤區(qū)域有選擇性放射性濃聚，72h放射性濃