人源化肺腺癌噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、目的：以肺腺癌患者區(qū)域轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)作為標(biāo)本來(lái)源，擬構(gòu)建可用于抗體篩選的人源化肺腺癌噬菌體單鏈抗體基因文庫(kù)。
　　方法：以肺腺癌患者區(qū)域轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)為標(biāo)本，采用RT-PCR方法反轉(zhuǎn)錄總RNA得到cDNA文庫(kù);擴(kuò)增從中獲得全套的可變區(qū)基因片段（VH和VL基因)；利用SOE-PCR技術(shù)隨機(jī)拼接VH和VL基因制備單鏈抗體可變區(qū)基因片段（single chain fragment variable，ScFv）；高效轉(zhuǎn)化克隆到噬菌體表達(dá)載體中的S

2、cFv，表達(dá)擴(kuò)增于大腸桿菌，得到針對(duì)肺腺癌細(xì)胞的初級(jí)噬菌體單鏈抗體庫(kù)；PCR鑒定ScFv片段陽(yáng)性插入率；2.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽(yáng)性克隆雙酶切產(chǎn)物；BstNⅠ酶鑒定其多樣性。
　　結(jié)果：以人源化肺腺癌區(qū)域轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)提取的總RNA，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后在UV下可見(jiàn)清晰的5S、18S、28S三條帶；VH基因片段大小約450bp，Vκ序列和Vλ基因片段大小約430bp；組裝后的ScFv(VH-K)、ScFv(VH-λ)基因大小約7

3、50bp；VH-κ庫(kù)連接轉(zhuǎn)化陽(yáng)性率92%（11/12），VH-λ庫(kù)連接轉(zhuǎn)化陽(yáng)性率83%（10/12）；VH-κ庫(kù)的相對(duì)庫(kù)容為1.16×106 PFU/ng，絕對(duì)庫(kù)容為2.56×107PFU/ml；VH-λ庫(kù)的相對(duì)庫(kù)容7.2×105 PFU/ng，絕對(duì)庫(kù)容1.48×107PFU/ml，BstNⅠ酶鑒定其多樣性良好。
　　結(jié)論：成功的構(gòu)建了人源化肺腺癌相關(guān)噬菌體單鏈抗體基因文庫(kù)，為進(jìn)一步篩選具有肺腺癌細(xì)胞特異性的人源化噬菌體單鏈抗體奠