肺腺癌人源噬菌體單鏈抗體制備及其在荷人肺腺癌裸鼠模型中的放免顯像.pdf

1、肺癌是主要威脅人類生命的腫瘤之一，特別是我國城市空氣污染嚴重的現(xiàn)狀以及煙民數(shù)量的快速增加，肺癌的發(fā)病率呈上升趨勢。專家預(yù)測，到2025年我國每年死于肺癌人數(shù)將超過100萬，而肺癌總治愈率仍僅15％左右，術(shù)后5年生存率為30％-50％。目前臨床上，肺癌的治療是以外科手術(shù)為主，并結(jié)合化療和放療的綜合治療。但對于手術(shù)不能切除的腫瘤，特別是對轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的中晚期腫瘤，只能采取化療、放療等輔助治療，由于其副作用較大而在臨床應(yīng)用中受到諸多限制。因此，國

2、內(nèi)外學(xué)者越來越多地將注意力轉(zhuǎn)向腫瘤的導(dǎo)向治療上。因為腫瘤的導(dǎo)向治療可以達到特異地殺傷癌細胞，并盡可能降低對正常細胞的毒副作用。如果將放射性核素偶聯(lián)具有導(dǎo)向性的特異性抗體，一方面通過抗體介導(dǎo)與腫瘤抗原特異結(jié)合，同時利用放射性核素所發(fā)出的射線，加強對癌細胞的作用，提高抗腫瘤的療效。10余年來，腫瘤的導(dǎo)向治療己作為一種重要的治療模式被廣泛研究和應(yīng)用于臨床。免疫顯像和免疫治療是生物治療的重要組成部分，對腫瘤及其轉(zhuǎn)移的診斷、精確分期和治療方案的確

3、定均有重要意義。 導(dǎo)向研究成功關(guān)鍵與否在于抗體的選擇和制備。自1975年Kohler和Milstein成功地制備第一株單克隆抗體以來，單抗的研究經(jīng)歷了鼠源性抗體人源化改造、小分子抗體和抗體展示文庫三個研究階段。其中抗體文庫的出現(xiàn)使基因工程抗體技術(shù)進入了一個新的發(fā)展階段。針對鼠源性單克隆抗體在人體應(yīng)用時易發(fā)生的異源性問題和導(dǎo)向治療中大分子抗體存在的穿透力較差的問題，我們嘗試用噬菌體抗體庫技術(shù)構(gòu)建肺腺癌相關(guān)的人源單鏈抗體文庫，并對文

4、庫進行初步篩選，制備肺腺癌人源單鏈抗體，標以放射性核素后，在荷人肺腺癌裸鼠模型中進行放免顯像。 目的：利用噬菌體抗體庫技術(shù)制備肺腺癌人源單鏈抗體，標以放射性核素，進行放免顯像研究，為肺癌的放免導(dǎo)向治療奠定基礎(chǔ)，為肺癌患者提供一種可行的有效的輔助治療手段。 方法與結(jié)果： 第一部分噬菌體抗體文庫的構(gòu)建1.人源單鏈抗體基因文庫的構(gòu)建：取肺腺癌病人癌腫周圍淋巴結(jié)作為B細胞的來源，提取淋巴結(jié)的總RNA。設(shè)計簡并引物，用RT

5、-PCR的方法分別擴增抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因cDNA文庫。首先分別用網(wǎng)格篩選確定擴增VH和VL基因片斷的引物對，以cDNA為模板擴增VH和VL基因片斷，再以VH和VL基因片斷為模板分別擴增VH-linker和VL-linker，然后用SOE-PCR技術(shù)將它們拼接后引入酶切位點Sfi I和Not I，膠回收PCR產(chǎn)物即得到scFv基因片斷。結(jié)果顯示：肺腺癌周圍淋巴結(jié)總RNA的提取瓊脂糖電泳結(jié)果中可見清晰的28S、18S條帶；擴增VH的引

6、物對為HuJH3FOR與HuVH5aBACK；擴增VL的引物對為HuJK4FOR與HuVk5aBACK；擴增VH-linker的引物對為HuJH3Linker與HuVH5aBACK；擴增VL-linker的引物對為HuJk4FOR與Linker-HuVk5aBACK；引入酶切位點的引物為HuVH5aBACKSfi與HuJk4FORNot。VH基因的大小為370bp，VL基因的大小為350bp，組裝后的scFv基因約為750bp。 2.單

7、鏈抗體基因文庫與噬菌體載體pCANTAB-5E的拼接：制備轉(zhuǎn)化效率達到108cfu/μg pUC18 DNA的高濃度電轉(zhuǎn)菌TG1。單鏈抗體PCR產(chǎn)物經(jīng)Sfi I和Not I雙酶切后，膠純化回收。酶切產(chǎn)物與噬菌體載體pCANTAB-5E連接反應(yīng)后，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，結(jié)果獲得2.2×107cfu/μg 氨芐青霉素抗性克隆。隨機進行酶切反應(yīng)鑒定，陽性插入率為83.3％(20/24)。酶切陽性質(zhì)粒測序結(jié)果證實抗體重鏈和輕鏈以整碼的單鏈抗體方

8、式準確插入了載體。 3.噬菌體抗體的展示：用2-YT培養(yǎng)液收集上述獲得的陽性插入克隆.進行M13K07輔助噬菌體的感染，在無糖環(huán)境下誘導(dǎo)單鏈抗體片段的噬菌體展示。重組噬菌體的滴度達到1012cfu/ml。 第二部分噬菌體抗體庫的初步篩選1.肺腺癌細胞株對抗體庫的富集：先以人成纖維細胞篩選后再用肺腺癌細胞A549對噬菌體抗體庫進行了5輪富集，對抗體庫富集前后滴度測定結(jié)果表明噬菌體滴度逐漸升高。第一輪噬菌體收獲率為1.59×

9、10-6，第五輪噬菌體收獲率為2.88×10-4，第五輪噬菌體收獲率是第一輪的181倍。 2.表達可溶性scFv抗體：強陽性重組噬菌體克隆感染E.coliHB2151，經(jīng)1mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達可溶性scFv抗體。 3.親和柱層析純化可溶性抗體：將上述可溶性抗體過HitrapTMAnti-E Tag柱進行親和柱層析，先用中性緩沖洗去未結(jié)合抗體，再用酸性緩沖洗脫結(jié)合的目的抗體，并用堿性緩沖中和，用A280檢測，合并峰值高

10、的溶液，進行蛋白定量。 4.用細胞ELISA測定可溶性抗體的免疫活性：肺腺癌A549的A405nm為0.71±0.05，乳腺癌細胞MDA-MB-435的A405nm為0.25±0.08，結(jié)果顯示可溶性抗體具有較高的特異性，能與肺腺癌細胞A549結(jié)合，而不與乳腺癌細胞MDA-MB-435結(jié)合。其中有6個噬菌體scFv與A549細胞反應(yīng)的P/N值大于MDA-MB-435的兩倍以上。 第三部分人源單鏈抗體的放射性核素標記及鑒定

11、用氯胺T法對肺腺癌細胞A549篩選后的可溶表達的單鏈抗體scFv進行131I標記，Sephadex G200柱層析進行純化，測定標記率、比活度、放射化學(xué)純度。分別測定131I-scFv在室溫和與新鮮人血清37℃孵育后放射化學(xué)純度的變化，了解其穩(wěn)定性。結(jié)果顯示：scFv的131I標記率為81.2±5.3％，比活度為3.1±0.2MBq/μg。Sephadex G200分離純化得到的第一放射峰即為131I-scFv，經(jīng)24h室溫穩(wěn)定性分析，

12、其放射化學(xué)純度略有降低，但均大于90％。與新鮮人血清37℃孵育分析其穩(wěn)定性，測得放射化學(xué)純度48h比1h略有降低，但均大于90％。 第四部分131I-scFv在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布及SPECT(單光子發(fā)射型計算機斷層)顯像131I-scFv在荷人肺腺癌裸鼠模型的體內(nèi)分布及在荷人肺腺癌裸鼠的SPECT顯像研究顯示：1.荷人肺腺癌裸鼠模型的體內(nèi)分布：在荷人肺腺癌裸鼠模型的體內(nèi)，131I-scFv的放射性瘤/血、瘤/肌肉比值逐漸升高，在

13、3d達峰值(瘤/血、瘤/肌肉比值分別為4.06±0.13、5.17±0.97)。2.荷人肺腺癌裸鼠的SPECT顯像：在腫瘤部位有放射性濃聚，可見到較清晰的腫瘤影像。結(jié)論：本研究利用噬菌體抗體庫技術(shù)制備的肺腺癌人源單鏈抗體，標以放射性核素，進行放免顯像，結(jié)果表明通過噬菌體抗體庫技術(shù)可以直接從肺腺癌病人癌周淋巴結(jié)中獲得相關(guān)的完全人源的單鏈抗體，以放射性核素131I標記，其標記率較高、放射化學(xué)純度高、比活度符合要求，且穩(wěn)定性好、靶向性較強，得