抗PeroxiredoxinⅠ肺腺癌噬菌體抗體的制備、抑制肺腺癌細(xì)胞增殖研究及其在荷人肺腺癌裸鼠模型中的放免顯像.pdf

1、肺癌是目前世界上死亡率最高的惡性腫瘤之一，與20世紀(jì)初相比，現(xiàn)在肺癌已經(jīng)成為威脅人類(lèi)健康和生命的最大敵人之一。目前肺癌的治療主要采取外科手術(shù)結(jié)合放療和化療的綜合治療。但肺癌早期少有癥狀或癥狀不明顯，因此導(dǎo)致患者出現(xiàn)癥狀就診者多屬中晚期，療效不佳。肺癌總的5年生存率在發(fā)達(dá)國(guó)家約為15％，我國(guó)低于10％。尋找新的治療手段成為提高腫瘤治療效果的突破口。其中，腫瘤的靶向治療具有良好的發(fā)展前景。腫瘤靶向治療強(qiáng)調(diào)治療的特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)盡

2、可能保護(hù)正常細(xì)胞。其中，基于放射免疫治療的原理，將放射性核素偶聯(lián)靶向性特異抗體，可將抗體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷效應(yīng)與放射性核素的治療作用結(jié)合起來(lái)，從而提高腫瘤治療的效果。
　　 靶向治療成功的關(guān)鍵在于抗體的制備及特異性靶點(diǎn)的選擇。作為最具應(yīng)用潛力的單克隆抗體，經(jīng)歷了鼠源性抗體的人源化改造、小分子抗體及文庫(kù)展示抗體三個(gè)階段。其中，以噬菌體展示文庫(kù)抗體為代表的第三代抗體是基因工程抗體技術(shù)的新發(fā)展。
　　 細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)與腫瘤的形

3、成密切相關(guān)，參與細(xì)胞氧化還原的蛋白可用于研究腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Peroxiredoxin蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)過(guò)氧化物酶，在清除活性氧族中具有重要作用，可以保護(hù)細(xì)胞免受過(guò)氧化反應(yīng)造成的膜損傷。PeroxiredoxinⅠ（PrxⅠ）是Peroxiredoxin蛋白家族成員之一，在肺腺癌細(xì)胞中高表達(dá)。PrxⅠ可以減少活性氧自由基的產(chǎn)生，其表達(dá)上調(diào)增強(qiáng)了腫瘤抗氧化能力，是抗凋亡和化療耐藥的重要原因。因此，PrxⅠ可以作為肺腺癌治療的特異性靶點(diǎn)

4、。
　　 為克服鼠源性單克隆抗體在人體應(yīng)用時(shí)的異源性及治療中大分子抗體穿透力較差的弊端，針對(duì)肺腺癌細(xì)胞高表達(dá)的。PrxⅠ蛋白，我們嘗試?yán)檬删w抗體庫(kù)技術(shù)構(gòu)建肺腺癌相關(guān)人源單鏈抗體庫(kù)，制備抗PrxⅠ肺腺癌人源單鏈抗體，評(píng)價(jià)其抑制肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，并標(biāo)記放射性核素后行荷人肺腺癌裸鼠放免顯像研究。
　　 目的：通過(guò)噬菌體展示技術(shù)制備抗PrxⅠ肺腺癌人源單鏈抗體并檢測(cè)抗體性能，抗體標(biāo)記放射性核素行放射免疫顯像研究，評(píng)價(jià)肺癌

5、放免靶向治療的可行性，為肺癌的治療提供新的輔助手段。
　　 方法與結(jié)果：
　　 第一部分、噬菌體抗體文庫(kù)的構(gòu)建
　　 1.人源單鏈抗體的制備：以肺腺癌病人癌旁淋巴結(jié)作為抗體B細(xì)胞來(lái)源，提取淋巴結(jié)總RNA。經(jīng)RT-PCR法擴(kuò)增得到cDNA文庫(kù)。以cDNA為模板擴(kuò)增VH和VL基因片段。再以VH和VL基因片段作為延伸連接肽的模板，分別用各自對(duì)應(yīng)引物擴(kuò)增VH-linker和VL-linker，再通過(guò)SOE-PCR反應(yīng)擴(kuò)增

6、得到scFv，引入酶切位點(diǎn)SfiⅠ和NotⅠ，膠回收PCR產(chǎn)物即得到scFv基因片段。結(jié)果表明，總RNA的電泳凝膠上可見(jiàn)2條帶18 S與28 S；VH基因的大小約為370 bp，VL基因的大小約為350 bp，組裝scFv基因大小約為750 bp。
　　 2.重組噬菌體載體pCANTAB-5E的制備：純化的單鏈抗體PCR產(chǎn)物分別經(jīng)SfiⅠ和NotⅠ雙酶切反應(yīng)后，與噬菌體載體pCANTAB-5E進(jìn)行拼接。電擊穿孔法將純化的拼接產(chǎn)物

7、轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1，得到2.8×107cfu/μg克隆。行隨機(jī)質(zhì)粒鑒定及雙酶切鑒定，陽(yáng)性插入率為88％（44/50）。陽(yáng)性質(zhì)粒行基因序列分析檢測(cè)單鏈抗體的完整性。
　　 3.噬菌體抗體的表達(dá)：用2×YT培養(yǎng)液收集上述陽(yáng)性質(zhì)粒，在M13KO7輔助噬菌體感染條件下，無(wú)糖環(huán)境誘導(dǎo)scFv片段的噬菌體表達(dá)。
　　 第二部分、噬菌體抗體庫(kù)的篩選
　　 1.肺腺癌細(xì)胞株對(duì)抗體庫(kù)的篩選：先以正常人支氣管上皮細(xì)胞HBE16

8、負(fù)性篩選后，以肺腺癌A549細(xì)胞對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行3輪富集，對(duì)抗體庫(kù)富集前后滴度測(cè)定結(jié)果顯示噬菌體收獲率逐漸升高。
　　 2.PrxⅠ抗原對(duì)抗體庫(kù)的篩選：將經(jīng)A549細(xì)胞篩選的抗體庫(kù)進(jìn)一步用PrxⅠ純化抗原進(jìn)行3輪篩選富集。一共進(jìn)行6輪篩選富集。第1輪噬菌體收獲率為1.3×10-6，第6輪噬菌體收獲率為2.3×104，是第1輪的180倍。
　　 3.可溶性scFv抗體的表達(dá)：將ELISA證實(shí)的強(qiáng)陽(yáng)性噬菌體抗體株感染大腸桿

9、菌E.coliHB2151，經(jīng)IPTG（1 mmol/L）誘導(dǎo)培養(yǎng)后獲得可溶性scFv抗體。經(jīng)HitrapTM Anti-E Tag親和層析柱純化后得到純化的可溶性抗體。
　　 4.可溶性抗體的鑒定：SDS-PAGE檢測(cè)可溶性抗體：將可溶性抗體行SDS-PAGE檢測(cè)?？捡R斯亮藍(lán)R250染色后觀察可見(jiàn)在約30 ku處有條帶出現(xiàn)，證實(shí)scFv抗體片段在大腸桿菌HB2151中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)。細(xì)胞ELISA測(cè)定可溶性抗體的免疫活性：肺腺

10、癌細(xì)胞A549的A405 nm值0.63±0.08，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435的A405 nm值0.36±0.05，正常支氣管上皮細(xì)胞HBE16的A405 nm值0.37±0.06。
　　 結(jié)果顯示，可溶性抗體具有較高的特異性，能與肺腺癌細(xì)胞A549結(jié)合?？贵w親和力測(cè)定：通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA評(píng)估可溶性抗體與A549細(xì)胞的親和力。結(jié)果顯示，當(dāng)抗體1：250稀釋時(shí)，IgG的結(jié)合抑制率為4.5％；當(dāng)抗體1：1稀釋時(shí)，結(jié)合抑制率增加到

11、66.1％。免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定可溶性抗體特異性：免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)表明，與MDA-MB-435細(xì)胞和HBE16細(xì)胞比較，A549細(xì)胞明顯深染，證實(shí)scFv抗體與肺腺癌細(xì)胞A549特異性結(jié)合。
　　 第三部分、噬菌體抗體抑制肺腺癌細(xì)胞增殖研究
　　 1.可溶抗體內(nèi)攝量測(cè)定：用氯胺T法將放射性核素標(biāo)記抗體，純化后與肺腺癌A549細(xì)胞37℃孵育30 min和120 min。以未篩選的scFv及抗iASPP scFv（實(shí)驗(yàn)室自備

12、）作為抗體對(duì)照，以4℃孵育條件作為溫度對(duì)照。孵育結(jié)束后PBS洗滌細(xì)胞，再以2％SDS溶解細(xì)胞，收集洗脫液和溶胞產(chǎn)物，分別測(cè)定洗脫液和溶胞產(chǎn)物的放射性計(jì)數(shù)。
　　 結(jié)果表明，相對(duì)于對(duì)照組，37℃條件下PrxⅠ特異性肺腺癌單鏈抗體能有效結(jié)合、進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。
　　 2.MTT及流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖、凋亡情況：?jiǎn)捂溈贵w作用于A549細(xì)胞72 h后進(jìn)行MTT分析，發(fā)現(xiàn)抗體對(duì)細(xì)胞有劑量依賴(lài)的抗增殖作用。AnnexinV-FITC/P

13、I法流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡，抗體干預(yù)組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯增加。
　　 3.PrxⅠ蛋白表達(dá)水平測(cè)定：?jiǎn)捂溈贵w干預(yù)A549細(xì)胞72 h后，提取總蛋白，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。
　　 結(jié)果顯示，樣品組PrxⅠ蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，證實(shí)可溶抗體干預(yù)后細(xì)胞PrxⅠ蛋白表達(dá)受到抑制，PrxⅠ表達(dá)量約為對(duì)照組的60％。
　　 第四部分、單鏈抗體的放射性核素標(biāo)記及鑒定
　　 氯胺T法將131Ⅰ標(biāo)

14、記可溶性單鏈抗體，經(jīng)Sephadex G200層析柱純化后測(cè)定抗體的放射性核素標(biāo)記率、比活度、放射化學(xué)純度以及37℃條件下核素標(biāo)記抗體與人血清孵育后放射化學(xué)純度變化。
　　 結(jié)果顯示，抗體的131Ⅰ標(biāo)記率為83.2±6.5％，比活度為2.8±0.2MBq/μg，放射化學(xué)純度為95.6±3.7％。核素標(biāo)記抗體與新鮮人血清孵育后測(cè)放射化學(xué)純度，第48 h測(cè)得值與第1 h比較無(wú)明顯降低，證實(shí)穩(wěn)定性較好。
　　 第五部分、核素標(biāo)

15、記抗體在荷肺腺癌裸鼠模型體內(nèi)的分布及SPECT顯像
　　 通過(guò)尾靜脈將核素標(biāo)記的單鏈抗體注射荷人肺腺癌裸鼠，不同時(shí)間點(diǎn)處死裸鼠，測(cè)定腫瘤及各組織％ID/g（每克組織百分注射劑量率）。同樣裸鼠模型在不同時(shí)間點(diǎn)行SPECT顯像。
　　 結(jié)果顯示，注射131Ⅰ-scFv后，腫瘤組織對(duì)抗體的攝取量逐漸增加，荷瘤裸鼠模型的瘤/血、瘤/肌肉放射性比值逐漸升高，并在第48 h達(dá)到峰值（瘤/血、瘤/肌肉比值分別為4.19±0.13、4.

16、89±0.56）。通過(guò)SPECT顯像觀察到在腫瘤區(qū)域的放射性濃聚，腫瘤組織得以顯像，以第48 h時(shí)顯像最為清晰。
　　 結(jié)論：本研究利用噬菌體展示技術(shù)制備抗PrxⅠ肺腺癌人源單鏈抗體，檢測(cè)抗體性能及抑制肺腺癌細(xì)胞增殖能力，經(jīng)放射性核素標(biāo)記后行體內(nèi)分布研究及放免顯像。結(jié)果表明成功利用噬菌體展示技術(shù)制備全人源特異性肺腺癌相關(guān)單鏈抗體，該抗體能有效抑制肺腺癌細(xì)胞增殖。經(jīng)放射性核素標(biāo)記的單鏈抗體符合放免顯像要求，靶向性較強(qiáng)，得到了較為滿(mǎn)