siRNA抑制DREAM基因表達(dá)治療神經(jīng)病理性痛的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、疼痛是一種與實(shí)際或潛在組織損傷相關(guān)聯(lián)的不愉快的感覺和情感體驗(yàn)，是一種復(fù)雜的生理心理活動(dòng)，是臨床上最常見的癥狀之一，也是促使人們就醫(yī)的最常見原因之一。慢性疼痛不僅僅是一種癥狀，也可以是一種疾病。任何人一生中都難免要遭受疼痛的折磨。全世界有三分之一以上的人正在不同程度地遭受著慢性疼痛的折磨，嚴(yán)重影響了工作、學(xué)習(xí)和生活。疼痛不會(huì)導(dǎo)致直接患者死亡，但有些患者因?yàn)槿淌懿涣碎L(zhǎng)時(shí)間的嚴(yán)重慢性疼痛而產(chǎn)生自殺的念頭，甚至采取自殺行為。麻醉性鎮(zhèn)痛藥和非甾體

2、消炎鎮(zhèn)痛藥仍然是目前疼痛治療的最主要藥物，但這些藥物特異性不高，療效并不理想，而且長(zhǎng)期使用可以引起藥物依賴、呼吸抑制、胃腸道損傷等嚴(yán)重副作用，相當(dāng)一部分病人不得不停止使用。頑固性癌痛和神經(jīng)病理性疼痛的治療是臨床醫(yī)師面臨的棘手課題，神經(jīng)病理性疼痛一般對(duì)阿片類藥物不敏感，抗抑郁藥和抗癲癇藥治療神經(jīng)病理學(xué)疼痛的療效不佳。因此，國內(nèi)外不少學(xué)者在不斷地探究疼痛產(chǎn)生的病理生理機(jī)制，尋求疼痛治療的新技術(shù)和新方法。 轉(zhuǎn)錄因子下游調(diào)控元件的拮抗分

3、子(Downstream regulatoryelement antagonist modulator,DREAM)是痛覺處理過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄抑制子之一，DREAM與前腦啡肽原基因(preprodynorphin，PPD)的DRE(Downstream regulatory element)位點(diǎn)結(jié)合，抑制PPD基因表達(dá)而發(fā)揮作用。DREAM痛覺調(diào)節(jié)作用的發(fā)現(xiàn)為疼痛治療提供了嶄新的研究靶點(diǎn)，我們可以通過阻斷DREAM基因，解除其對(duì)PPD基

4、因表達(dá)抑制，激活內(nèi)源性強(qiáng)啡肽/к受體鎮(zhèn)痛系統(tǒng)，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和RNA干擾技術(shù)的不斷完善，RNAi已經(jīng)成為當(dāng)今生命科學(xué)研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。RNAi具有高度特異性和高效性，并有強(qiáng)大的細(xì)胞穿透能力，可在細(xì)胞間傳遞，甚至遺傳給子代等特點(diǎn)。RNA干擾是研究生物體基因表達(dá)、調(diào)控與功能的新技術(shù)，是一種快捷高效、特異性強(qiáng)的抑制基因表達(dá)的工具。近年來有人將RNAi技術(shù)用于疼痛

5、治療實(shí)驗(yàn)研究取得成功。如2004年Dorn等將他們將化學(xué)合成的針對(duì)P2X3的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)經(jīng)鞘內(nèi)注入，顯著減輕了大鼠神經(jīng)病理性疼痛，不伴有明顯的毒性反應(yīng)和非特異性反應(yīng)。提示RNAi技術(shù)用于疼痛的基因治療是可行的。 本研究的目的是利用RNA干擾技術(shù)抑制DREAM基因表達(dá)，開展對(duì)神經(jīng)病理性疼痛基因治療的實(shí)驗(yàn)研究。整個(gè)研究分三部分進(jìn)行，第一部分觀察設(shè)計(jì)的針對(duì)DREAM基因的SiR

6、NA在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的RNA干擾效應(yīng)，確定針對(duì)DREAM基因進(jìn)行RNA干擾的有效作用位點(diǎn)，為后續(xù)的慢病毒載體的構(gòu)建及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。利用在線網(wǎng)站的生物軟件設(shè)計(jì)多個(gè)DREAM基因的RNA干擾序列，構(gòu)建RNA干擾質(zhì)粒，然后利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，通過熒光顯微鏡觀察、Realtime-PCR測(cè)定DREAM基因的mRNA含量、Western Blot測(cè)定。DREAM蛋白含量以觀察RNA干擾效應(yīng)。結(jié)果顯示針對(duì)示針對(duì)DREAM基因設(shè)計(jì)了3

7、條SiDREAM序列并構(gòu)建了siRNA表達(dá)載體在培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染率為85％，其中siRNA表達(dá)載體pRNAT-DREAM-Ⅱ和pRNAT-DREAM-Ⅲ使DREAM基因mRNA分別下調(diào)59％和47％，DREAM蛋白的表達(dá)亦明顯降低。第二部分是針對(duì)DREAM基因有效的RNA干擾作用位點(diǎn)構(gòu)建能夠在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA的慢病毒載體。根據(jù)第一部分實(shí)驗(yàn)篩選出的有效的siRNA序列設(shè)計(jì)合成適當(dāng)?shù)囊?，重組到慢病毒穿梭質(zhì)粒中，將重組質(zhì)粒pKC

8、SHR-puro/GFP-DREAM和慢病毒包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝出復(fù)制缺陷的慢病毒顆粒，并進(jìn)行載體病毒滴度的測(cè)定。結(jié)果成功構(gòu)建了慢病毒質(zhì)粒pKCSHR-puro/GFP-DREAM，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的siRNA序列完全一致，將質(zhì)粒pKCSHR-puro/GFP-DREAM與慢病毒包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞獲得滴度為1.0×108ifu/ml慢病毒顆粒。第三部分是將攜帶有siDREAM的慢病毒顆粒注入大鼠體內(nèi)，研究siDREAM的

9、RNA干擾效應(yīng)，為以后臨床實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。將純種健康清潔級(jí)成年雄性SD大鼠36只，隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組(N)、假手術(shù)組(S)，根據(jù)干預(yù)手段的不同將CCI疼痛模型組分為4組：CCI組(CO組)，CCI疼痛模型建立后不給任何干預(yù)措施，觀察術(shù)后3d、7d、10d、14d、21d的疼痛行為學(xué)的改變。生理鹽水對(duì)照組(C1組)，空白載體對(duì)照組(C2組)，pKCSHR-puro/GFP-DREAM治療組(C3組)。該三組大鼠于CCI后第7天分別于蛛

10、網(wǎng)膜下腔注射生理鹽水、空白載體、pKCSHR-puro/GFP-DREAM病毒載體，觀察各組術(shù)后3d、7d、10d、14d、21d的疼痛行為學(xué)的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)束取腰段脊髓進(jìn)行熒光顯微鏡檢測(cè)GFP(綠色熒光蛋白)的表達(dá)，Realtime-PCR測(cè)定DREAM基因的mRNA含量、Western Blot測(cè)定DREAM蛋白含量以觀察RNA干擾效應(yīng)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射pKCSHR-Puro/GFP-DREAM慢病毒載體后，CCI大鼠熱痛閾

11、和機(jī)械痛閾的異常明顯得到改善，腰段脊髓神經(jīng)細(xì)胞DREAM基因mRNA和DREAM蛋白的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。 本研究所得到的結(jié)論如下： 1.成功構(gòu)建了針對(duì)DREAM基因特異性siRNA表達(dá)載體，在體外培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中產(chǎn)生針對(duì)DREAM基因特異性的RNA干擾效應(yīng)，并確定了最佳作用位點(diǎn)為536～555。 2.成功構(gòu)建了表達(dá)siDREAM的慢病毒質(zhì)粒載體一pKCSHR-Puro/GFP-DREAM，并與慢

12、病毒包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得了滴度高達(dá)1.0 X 108 ifu/ml慢病毒顆粒。 3.鞘內(nèi)注射pKCSHR-Puro/GFP-DREAM慢病毒顆?？筛咝мD(zhuǎn)染到大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，能夠有效改善CCI大鼠痛覺異常，初步證實(shí)具有鎮(zhèn)痛效應(yīng)，為疼痛的基因治療提供了新的思路。 4.鞘內(nèi)注射pKCSHR-Puro/GFP-DREAM慢病毒顆粒可使大鼠腰段脊髓內(nèi)DREAM基因mRNA表達(dá)下調(diào)，DREAM蛋白表達(dá)降低，提示pKC