塞來(lái)昔布對(duì)非小細(xì)胞肺癌的抑制作用和放療、化療增敏作用的研究.pdf

1、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌發(fā)病的80％，其惡性度高，對(duì)放療、化療不敏感，5年生存率低。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)氧合酶-2(COX-2)與腫瘤關(guān)系密切，在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中表達(dá)增高。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)COX-2抑制劑可有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，并增加放療和化療的細(xì)胞毒性，但不增加放化療對(duì)正常組織的毒性。塞來(lái)昔布是一種新型的選擇性COX-2的抑制劑，于1998年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于預(yù)防家族性腸息肉的惡變。本研究探討了塞來(lái)昔布對(duì)NSCLC的抑制作用及

2、其放化療增敏作用，旨在為塞來(lái)昔布的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，為NSCLC的治療提供新的思路。本實(shí)驗(yàn)分為如下三個(gè)部分： 第一部分：塞來(lái)昔布對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用和侵襲抑制作用的研究 目的：研究選擇性環(huán)氧合酶-2抑制劑塞來(lái)昔布對(duì)非小細(xì)胞肺癌增殖抑制作用和侵襲抑制作用。 方法：1.四唑氮藍(lán)比色試驗(yàn)(MTT)檢測(cè)塞來(lái)昔布對(duì)肺腺癌細(xì)胞株A549和肺鱗癌細(xì)胞株NCI-H520的體外增殖抑制作用。2.建立A549裸鼠移植

3、瘤模型，予以塞來(lái)昔布干預(yù)，檢測(cè)塞來(lái)昔布對(duì)非小細(xì)胞肺癌體內(nèi)的增殖抑制作用。3.體外侵襲試驗(yàn)檢測(cè)塞來(lái)昔布對(duì)肺腺癌細(xì)胞株A549和肺鱗癌細(xì)胞株NCI-H520的體外侵襲的抑制作用。 結(jié)果：1.塞來(lái)昔布對(duì)肺腺癌細(xì)胞株A549和肺鱗癌細(xì)胞株NCI-H520均有明顯的體外增殖抑制作用，而且隨塞來(lái)昔布劑量的增大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用明顯增強(qiáng)，即有明顯的時(shí)間和劑量依賴(lài)關(guān)系。2.在相伺條件下，比較塞來(lái)昔布對(duì)兩種細(xì)胞株增殖抑制率，150umol

4、/L塞來(lái)昔布作用24小時(shí)、100umol/L塞來(lái)昔布作用48小時(shí)、50～100umol/L塞來(lái)昔布作用72小時(shí)后，塞來(lái)昔布對(duì)肺鱗癌NCI-H520的抑制率明顯高于對(duì)肺腺癌A549的抑制率(P＜0.05、P＜0.01)。3.塞來(lái)昔布可明顯抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。在塞來(lái)昔布治療組，腫瘤的體積為369.33mm3，重量為0.19g，均明顯低于對(duì)照組(P＜0.05、P＜0.01)，抑瘤率為69.35％。4.塞來(lái)昔布對(duì)NSCLC有明顯的侵襲抑制作用

5、，呈劑量依賴(lài)性。25和50umol/L塞來(lái)昔布作用24小時(shí)，A549穿膜細(xì)胞數(shù)分別為122.8和74.2，NCI-H520穿膜細(xì)胞數(shù)分別為84.4和53.8，均明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)。 結(jié)論：1塞來(lái)昔布對(duì)NSCLC在體內(nèi)外有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。2塞來(lái)昔布對(duì)H520的增殖抑制作用強(qiáng)于對(duì)A549的增殖抑制作用，提示塞來(lái)昔布對(duì)鱗癌的抑制作用強(qiáng)于腺癌。3塞來(lái)昔布對(duì)NSCLC有明顯的侵襲抑制作用，提示塞來(lái)昔

6、布有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲的作用。 第二部分：塞來(lái)昔布抑制非小細(xì)胞肺癌的作用機(jī)制的研究——細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡、COX-2依賴(lài)機(jī)制? 目的：從細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡、COX-2依賴(lài)機(jī)制三個(gè)方面探討塞來(lái)昔布對(duì)NSCLC抑制作用的機(jī)制。 方法：1.MTT法檢測(cè)加用PGE2后塞來(lái)昔布對(duì)NSCLC抑制率的改變。2.應(yīng)用透射電鏡形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、DNA凝膠電泳分析檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡。3.應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的分布。4

7、.應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)P21、P27、XIAP、SurvivinmRNA的表達(dá)水平。5.應(yīng)用westernblot檢測(cè)survivin、P27KIP1蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果：1.PGE2對(duì)塞來(lái)昔布抗NSCLC細(xì)胞增殖作用無(wú)影響，100umol/L塞來(lái)昔布+200umol/L的PGE2、100umol/L塞來(lái)昔布+300umol/L的PGE2作用24小時(shí)～72小時(shí)，其增殖抑制率與對(duì)照組(單獨(dú)100umol/L塞來(lái)昔布)無(wú)差異。2.

8、誘導(dǎo)凋亡的作用：透射電鏡、DNA凝膠電泳分析證實(shí)了塞來(lái)昔布組凋亡的存在，流式細(xì)胞儀檢測(cè)25-150umol/L塞來(lái)昔布作用于A549細(xì)胞24小時(shí)后所誘導(dǎo)的凋亡率分別為15.7％、26.8％、76.2％、86.7％，其中50-150umol/L塞來(lái)昔布組凋亡率顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，組間有顯著性差異(P＜0.05)；25-150umol/L塞來(lái)昔布作用于NCI-H520細(xì)胞24小時(shí)后所誘導(dǎo)的凋亡率分別為11.8％、15.7％、41

9、.1％、80.0％，其中100-150umol/L塞來(lái)昔布組凋亡率顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，組間有顯著性差異(P＜0.05)。3.細(xì)胞周期的改變：A549細(xì)胞經(jīng)25-100ummol/L塞來(lái)昔布作用后,G0/G1細(xì)胞比例為85.42％、86.47％、84.73％、88.7％，100ummol/L組明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。NCI-H520細(xì)胞經(jīng)25-100ummol/L塞來(lái)昔布作用24小時(shí)后，G0/G1細(xì)胞比例分別為62.3

10、7％、64.86％、66.04％、70.41％，其中50-100umol/L組G0/G1細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01)。4.50-150umol/L塞來(lái)昔布作用24小時(shí)后，NSCLC細(xì)胞的survivinmRNA及蛋白的表達(dá)逐漸降低，成劑量依賴(lài)性。5.50-150umol/L塞來(lái)昔布作用24小時(shí)后，NSCLC細(xì)胞的XIAPmRNA的表達(dá)逐漸降低。6.50-150umol/L塞來(lái)昔布作用24小時(shí)后，NSCLC細(xì)胞P2

11、1mRNA的表達(dá)逐漸增加，成劑量依賴(lài)性。7.50-150umol/L塞來(lái)昔布作用24小時(shí)后，NSCLC細(xì)胞P27mRNA及蛋白的表達(dá)逐漸增加，成劑量依賴(lài)性。 結(jié)論：1PGE2不能逆轉(zhuǎn)塞來(lái)昔布對(duì)NSCLC的增殖抑制作用，表明塞來(lái)昔布對(duì)非小細(xì)胞的抑制作用為非COX-2依賴(lài)途徑。2塞來(lái)昔布抑制NSCLC的機(jī)制涉及細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡兩方面。3塞來(lái)昔布誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能通過(guò)降低XIAP、survivin的表達(dá)而誘導(dǎo)凋亡的

12、發(fā)生。4塞來(lái)昔布導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯的機(jī)制是通過(guò)增加P21WAF1、P27KIP1的表達(dá)水平，導(dǎo)致細(xì)胞阻滯于G0/G1期。 第三部分：塞來(lái)昔布對(duì)非小細(xì)胞肺癌的放療和化療的增敏作用及機(jī)制 目的：探討塞來(lái)昔布對(duì)NSCLC的放療和化療增敏作用及其機(jī)制。 方法：1.MTT法檢測(cè)放療、順鉑(DDP)、足葉乙甙(VP16)單獨(dú)應(yīng)用的增殖抑制率及與塞來(lái)昔布聯(lián)合應(yīng)用的增殖抑制率，并根據(jù)金氏公式計(jì)算Q值，評(píng)價(jià)兩藥的合用效應(yīng)。2.應(yīng)用流

13、式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各處理組的凋亡率。 結(jié)果：1.DDP對(duì)肺腺癌、鱗癌細(xì)胞株均有明顯的體外抑制作用，且抑制作用呈劑量依賴(lài)型和時(shí)間依賴(lài)性。2.1.25、2.5mg/L的DDP分別聯(lián)合25、50umol/L塞來(lái)昔布后對(duì)NSCLC抑制作用明顯增強(qiáng)，且兩藥聯(lián)合的Q值＞1.15,二者合用有協(xié)同作用。3.VP16對(duì)肺腺癌、鱗癌細(xì)胞株均有明顯的體外抑制作用，且抑制作用呈劑量依賴(lài)型和時(shí)間依賴(lài)性。4.1.25、2.5mg/L的VP16分別聯(lián)合25、50u

14、mol/L塞來(lái)昔布后對(duì)NSCLC抑制作用明顯增強(qiáng)，且兩藥聯(lián)合的Q值＞1.15,二者合用有協(xié)同作用。5.50umol/L塞來(lái)昔布與2.5mg/LDDP聯(lián)合作用于A549、H520細(xì)胞24小時(shí)，凋亡率為55.27％和42.93％，聯(lián)合用藥的凋亡率明顯高于單用藥組(P＜0.01)。6.3Gy放療聯(lián)合25-75umol/L塞來(lái)昔布作用24-72小時(shí)抑制率均顯著高于單獨(dú)放療組，且隨塞來(lái)昔布劑量增大、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率明顯增加。7.放療聯(lián)合50