針對(duì)HER2-neu的siRNA對(duì)非小細(xì)胞肺癌生長(zhǎng)的抑制作用.pdf

1、肺癌的死亡率在世界范圍內(nèi)居惡性腫瘤首位，近年雖然來(lái)出現(xiàn)了一些新的化療藥物，但其治愈率仍然低于15％。HER2/neu(erbB2)基因，編碼蛋白大小為185KDa，具有酪氨酸蛋白激酶活性，為表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)家族成員，與EGFR高度同源。HER2/neu蛋白可以與家族其他成員形成異源二聚體，從而發(fā)揮強(qiáng)有力的腫瘤信號(hào)傳導(dǎo)作用。研究顯示，HER2/neu介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)與腫瘤的形成、增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲及放化療耐受有關(guān)。約1/3非小細(xì)胞

2、肺癌(NSCLC)存在HER2/neu過表達(dá)，其在NSCLC形成、增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等方面的作用尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。 RNA干涉(RNAi)是雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的、序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)現(xiàn)象，廣泛存在于多種自然界。RNAi的核心功能是抗病毒感染免疫，維持基因組中轉(zhuǎn)座子的穩(wěn)定性，清除異常RNA，同時(shí)參與基因表達(dá)調(diào)控。目前，RNAi技術(shù)己發(fā)展成為一種新型的基因阻斷技術(shù)，用于高效特異地關(guān)閉或降低特定基因的表達(dá)，已

3、被廣泛用于新基因篩選、基因功能鑒定以及基因治療等方面，在腫瘤、病毒感染等治療方面已取得積極進(jìn)展，顯示了非常廣闊的應(yīng)用前景。但是針對(duì)HER2/neu的RNAi對(duì)NSCLC的研究報(bào)道少見。 研究目的 本研究利用siRNA沉默肺癌細(xì)胞HER2/neu表達(dá)后，通過體外體內(nèi)系列實(shí)驗(yàn)觀察腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，了解HER2/neu基因在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，檢測(cè)RNA干涉效果并探討該方法應(yīng)用于肺癌基因治療的潛在應(yīng)用價(jià)值，為肺癌的

4、治療提供一條新思路。 研究?jī)?nèi)容 1.根據(jù)人HER2/neumRNA基因編碼區(qū)序列，首先設(shè)計(jì)并合成針對(duì)HER2/neu的兩兩互補(bǔ)的4條64nt的小發(fā)夾RNA(shRNA)模板脫氧寡核苷酸序列，然后構(gòu)建針對(duì)HER2/neu的siRNA表達(dá)質(zhì)粒pSUPER-siHER1和pSUPER-siHER2，并進(jìn)行酶切鑒定和DNA測(cè)序；其次將構(gòu)建正確的pSUPER-siHER2載體中的H1啟動(dòng)子連同編碼siRNA的模板序列用EcoRI和

5、XhoI切出，再連接入去除CMV啟動(dòng)子的pcDNA3.0載體，構(gòu)建成帶有新霉素抗性篩選標(biāo)志的pcDNA3.0-siHER2表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切鑒定。 2.利用WesternBlot、間接免疫熒光染色和RT-PCR方法對(duì)4株NSCLC細(xì)胞系Calu-3、SPC-A-1、A549和PLA-801進(jìn)行HER2/neu蛋白和mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)。 3.應(yīng)用增強(qiáng)綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-3轉(zhuǎn)染Calu-3和SPC-A-1細(xì)

6、胞，檢測(cè)質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。 4.將siRNA表達(dá)質(zhì)粒pSUPER-siHER2與pcDNA3.0空載體按摩爾比10：1瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染或?qū)⒅亟M質(zhì)粒pcDNA3.0-siHER2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過表達(dá)HER2/neu的SPC-A-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后72h收集細(xì)胞，用RT-PCR和Westernblot檢測(cè)HER2/neumRNA和蛋白水平表達(dá)，并觀察導(dǎo)入的siRNA對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞生長(zhǎng)速度的影響。 5.將pSUPER-siHER2或pc

7、DNA3.0-siHER2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肺腺癌SPC-A-1、Calu-3細(xì)胞，400μg/mlG418抗性篩選SPC-A-1以獲得穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株；50μg/mlG418抗性篩選Calu-3；RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞HER2/neumRNA的表達(dá)；免疫熒光染色和WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞HER2/neu蛋白表達(dá)；FCM檢測(cè)細(xì)胞周期分布；集落形成實(shí)驗(yàn)觀察單細(xì)胞增殖能力；MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線觀察體外細(xì)胞的增殖能力，并利用WesternBl

8、ot方法動(dòng)態(tài)觀察siRNA對(duì)HER2/neu的長(zhǎng)期抑制作用。 6.裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)：將單克隆細(xì)胞株按7×106接種裸鼠皮下，觀察出瘤情況，至出現(xiàn)瘤塊后每3d測(cè)量一次腫瘤大小，第32d結(jié)束實(shí)驗(yàn)，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率包括瘤體抑制率和瘤重抑制率。 結(jié)果 1.酶切鑒定結(jié)果顯示重組質(zhì)粒的插入片段大小與預(yù)期相符，表明脫氧寡核昔酸片段己克隆入重組質(zhì)粒；DNA測(cè)序證實(shí)該重組質(zhì)粒序列與所設(shè)計(jì)序列完全一致，表明針對(duì)HER2/neu的s

9、iRNA表達(dá)載體己構(gòu)建成功，重組質(zhì)粒分別命名為pSUPER-siHER1，pSUPER-siHER2和pcDNA3.0-siHER2。 2.4株NSCLC均存在HER2/neu表達(dá)，其中首次證實(shí)肺腺癌SPC-A-1和肺大細(xì)胞癌PLA-801HER2/neu表達(dá)陽(yáng)性，并且Calu-3和SPC-A-1存在HER2/neu蛋白和mRNA水平的過表達(dá)。 3.應(yīng)用綠色熒光蛋白報(bào)告基因質(zhì)粒pEGFP-3轉(zhuǎn)染Calu-3和SPC-A-

10、1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SPC-A-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)到59.56％，適合脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；而Calu-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率僅約1％，不適合脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染研究。 4.將針對(duì)HER2/neu的siRNA重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肺腺癌SPC-A-1、Calu-3細(xì)胞，400μg/mlG418抗性篩選SPC-A-1獲得了穩(wěn)定表達(dá)HER2/neusiRNA的多株單克隆細(xì)胞株；而50μg/mlG418抗性篩選Calu-3長(zhǎng)達(dá)4個(gè)月，始終未獲得穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株。

11、5.將針對(duì)HER2/neu的siRNA重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SPC-A-1細(xì)胞，HER2/neumRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)受抑制，siRNA主要阻抑細(xì)胞于G0/G1期，細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢。 6.將針對(duì)HER2/neu的siRNA重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SPC-A-1細(xì)胞經(jīng)G418抗性篩選獲了多株穩(wěn)定表達(dá)siRNA的單克隆細(xì)胞株，結(jié)果表明：①2種siRNA均能明顯降低HER2/neumRNA的表達(dá)，轉(zhuǎn)染組幾乎完全受到抑制；②siRNA顯著抑制細(xì)胞H

12、ER2/neu蛋白質(zhì)合成；③細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少；④細(xì)胞生長(zhǎng)曲線左移、增殖速度明顯減慢；⑤體外單細(xì)胞細(xì)胞集落形成能力顯著下降，集落形成抑制率達(dá)到49.0％；⑥對(duì)細(xì)胞HER2/neu表達(dá)的持久、動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，單克隆細(xì)胞株在長(zhǎng)達(dá)4個(gè)月的培養(yǎng)過程中對(duì)HER2/neu的抑制率幾乎維持不變，表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染針對(duì)HER2/neu的siRNA能夠持久、高效地抑制肺癌細(xì)胞HER2/neu基因的表達(dá)。 7.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：針對(duì)HE

13、R2/neu的siRNA表達(dá)質(zhì)粒明顯抑制了裸鼠體內(nèi)肺腺癌腫瘤形成及增長(zhǎng)速度，瘤重抑制率達(dá)到57％，瘤體抑制率達(dá)到51％。 結(jié)論 1.設(shè)計(jì)、合成了兩個(gè)針對(duì)HER2/neu的特異性siRNA脫氧寡核甘酸序列，構(gòu)建了HER2/neu的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，建立和篩選出了穩(wěn)定表達(dá)HER2/neusiRNA的單克隆細(xì)胞株。 2.證實(shí)4株細(xì)胞均存在HER2/neu表達(dá)，其中首次檢測(cè)到SPC-A-1和PLA-801的HER2/n

14、eu表達(dá)陽(yáng)性，Calu-3和SPC-A-1同時(shí)存在HER2/neumRNA和蛋白水平的過表達(dá)。 3.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們?cè)O(shè)計(jì)的針對(duì)HER2/neu的重組質(zhì)粒產(chǎn)生的siRNA能夠穩(wěn)定、高效、特異、持久地抑制肺癌細(xì)胞SPC-A-1HER2/neu表達(dá)，阻滯細(xì)胞于G0/G1期，顯著抑制細(xì)胞增殖能力和集落形成能力。 4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，針對(duì)HER2/neu的siRNA可以有效抑制裸鼠移植瘤ER2/neu表達(dá)和移植瘤增殖速度。