不同洗滌離心力對(duì)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞純化的影響.pdf

1、目的：由于間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)對(duì)于人類(lèi)疾病治療具有潛在的、可預(yù)期的重大影響，近年來(lái)，許多學(xué)者致力于應(yīng)用MSCs治療疾病的基礎(chǔ)與臨床研究，其中，以臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(UCB-MSCs)的研究為主導(dǎo)。目前，UCB-MSCs已被成功誘導(dǎo)分化為多種組織細(xì)胞，不少學(xué)者也對(duì)UCB-MSCs的分離純化技術(shù)進(jìn)行了探索，對(duì)其培養(yǎng)方法、培養(yǎng)條件進(jìn)行了諸多的改良和優(yōu)化，但在不同洗滌離心力對(duì)UCB-MSCs純化的影響方面卻鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者在進(jìn)行UCB-MSCs

2、培養(yǎng)時(shí)，反復(fù)使用大部分學(xué)者采用[1]的1500r/min離心10min(r=15cm，相對(duì)離心場(chǎng)RCF=378g)洗滌技術(shù)，始終未能獲得滿意的細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)結(jié)果，分析認(rèn)為是由于該洗滌方法所得到的細(xì)胞純度不高所致。由于不同離心力洗滌對(duì)于干細(xì)胞純化的影響舉足輕重，故有必要對(duì)其進(jìn)行深入的研究。本實(shí)驗(yàn)在其它實(shí)驗(yàn)條件不變的基礎(chǔ)上，首先將臍血離心并有效分層，然后使用不同離心力洗滌，觀察對(duì)比不同洗滌離心力對(duì)UCB-MSCs純化的影響，以期尋找出更有利

3、于干細(xì)胞純化的適宜洗滌離心技術(shù)，為UCB-MSCs培養(yǎng)提供更好的基礎(chǔ)條件。
　　方法：選擇滿足UCB-MSCs采集適應(yīng)癥的孕婦8名，無(wú)菌采集臍血約40ml。首先以1:1比例用0.9％生理鹽水將臍血稀釋?zhuān)缓蟀凑?:1比例將稀釋后臍血緩緩加入淋巴細(xì)胞分離液(1.077g/ml)中，2000r/min離心20min(671 g)，將臍血有效分層。輕輕吸取中間白膜層約30ml，添加0.9％生理鹽水至50ml后混勻，將其平均分為5份，每份

4、10ml，分別以1500r/min離心10min(378g)、1300r/min離心10min(284g)、1200r/min離心10min(242g)、1000 r/min離心10min(168g)、800 r/min離心10min(107g)，洗滌后均棄上清液，余細(xì)胞沉淀約0.5ml，加入L-DMEM-10％胎牛血清-慶大霉素培養(yǎng)基至10ml，混勻后分別接種于T25培養(yǎng)瓶，倒置相差顯微鏡下觀察(放大倍數(shù)10×20)，選取混雜物質(zhì)數(shù)量

5、居中的視野，對(duì)比每組混雜物質(zhì)的差異并行圖像采集，使用多項(xiàng)目自動(dòng)血球分析裝置(XT-1800i)分析每份細(xì)胞懸液，記錄其單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)密度(109/L)、紅細(xì)胞(RBCs)密度(109/L)、血小板(PLT)密度(109/L)、MNCs率(％)，使用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并繪制曲線圖。另外，移液槍吸取每份細(xì)胞懸液一滴涂片，行瑞氏染色，于油鏡下觀察雜質(zhì)情況并采集圖像。在細(xì)胞接種后第7天棄全部培養(yǎng)液，倒置相差顯微鏡

6、下觀察，于各接種瓶中選取貼壁細(xì)胞數(shù)量居中的的視野5個(gè)，分別計(jì)數(shù)后行方差分析，并觀察對(duì)比梭狀細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞接種后第14天，分別觀察每瓶細(xì)胞生長(zhǎng)情況，選取生長(zhǎng)情況居中的視野采集圖像。
　　結(jié)果：1、比較不同離心力洗滌后接種當(dāng)時(shí)在倒置相差顯微鏡下觀察到的情況，1500r/min洗滌、1300r/min洗滌接種瓶中除大量細(xì)胞外，可見(jiàn)大量混雜物質(zhì)，而1200r/min洗滌、1000 r/min洗滌、800r/min洗滌接種瓶中除大量細(xì)胞外，混

7、雜物質(zhì)明顯低于前兩者，800r/min洗滌接種瓶尤為顯著，將細(xì)胞懸液涂片行瑞氏染色后于油鏡下觀察(放大倍數(shù)10×1000)，結(jié)果同倒置相差顯微鏡下觀察。2、將不同離心力洗滌后所得的MNCs密度(109/L)、RBCs密度(109/L)、PLT密度(109/L)、MNCs率(％)繪制成曲線圖，并行方差分析，其中MNCs密度(109/L)隨洗滌離心力降低有降低的趨勢(shì)、MNCs率(％)隨洗滌離心力降低有升高的趨勢(shì)，但二者的差別均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

8、義(P>0.05)，PLT密度(109/L)、RBCs密度(109/L)隨洗滌離心力降低有降低的趨勢(shì)，其數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3、細(xì)胞接種后第7天，于各接種瓶中選取貼壁細(xì)胞數(shù)量居中的的視野5個(gè)，分別計(jì)數(shù)后行方差分析，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，觀察對(duì)比梭狀細(xì)胞數(shù)，800r/min洗滌的各接種瓶中，梭狀細(xì)胞數(shù)≥5個(gè)/視野的約有5-8個(gè)視野，1200r/min洗滌、1000 r/min洗滌的各接種瓶中約有1-3個(gè)

9、，1500r/min洗滌、1300r/min洗滌的各接種瓶中無(wú)滿足條件的視野。4、接種14天后倒置相差顯微鏡下觀察，800r/min洗滌的接種瓶中細(xì)胞生長(zhǎng)情況相對(duì)最佳，2-5個(gè)視野下可見(jiàn)梭狀細(xì)胞融合抱團(tuán)生長(zhǎng)(抱團(tuán)細(xì)胞數(shù)≥7個(gè)/視野)，其余接種瓶從未見(jiàn)抱團(tuán)生長(zhǎng)情況，且細(xì)胞趨于死亡。
　　結(jié)論：1.在使用淋巴細(xì)胞分離液(1.077g/ml)進(jìn)行密度梯度離心法分離提純UCB-MSCs時(shí)，目前普遍采用的1500r/min離心10min(r

10、=15cm，相對(duì)離心場(chǎng)RCF=378g)洗滌法所獲得的細(xì)胞純度不高，其中含大量混雜物質(zhì)，不利于UCB-MSCs貼壁、生長(zhǎng)和分化，低離心力洗滌可使UCB-MSCs純度大大提高，利于UCB-MSCs貼壁和生長(zhǎng)、分化，800r/min離心10min洗滌效果最佳；2、在使用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心法分離提純UCB-MSCs時(shí)，RBCs殘余量對(duì)UCB-MSCs貼壁的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于PLT殘余量對(duì)其的影響，PLT殘余量可能才是影響UCB-MSCs