PI3K-AKT-PTEN-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)膽管癌細(xì)胞凋亡抑制作用及化療增敏作用的研究.pdf

1、人體的整體功能上的協(xié)調(diào)統(tǒng)一是通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞間的相互識(shí)別、聯(lián)絡(luò)和相互作用而實(shí)現(xiàn)的，這種存在于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的識(shí)別、聯(lián)絡(luò)和相互作用，又在多個(gè)層次上具有交叉調(diào)控，形成了一個(gè)十分復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。我們把細(xì)胞接受外界信號(hào)，通過(guò)一整套特定的機(jī)制，將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為胞內(nèi)信號(hào)，最終調(diào)節(jié)特定基因表達(dá)，并引起細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)稱(chēng)為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。細(xì)胞的種種功能活動(dòng)受到復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，精細(xì)調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是正常生命活動(dòng)的前提，而信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異?？梢詫?dǎo)致病理過(guò)程

2、。 許多研究表明，如果控制細(xì)胞增殖、分化的信息傳遞通路中某一環(huán)節(jié)異常，就會(huì)引起細(xì)胞生長(zhǎng)失控，可以導(dǎo)致腫瘤形成或者腫瘤凋亡。在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，以PI3-K/Akt/PTEN/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)凋亡的調(diào)節(jié)作用尤其重要。PI3-K/Akt/PTEN/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路活化可以抑制多種刺激誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，從而促進(jìn)細(xì)胞的生存和增殖，同時(shí)參與血管形成，在腫瘤的形成中扮演重要角色，并參與腫瘤的侵襲

3、和轉(zhuǎn)移。而且該信號(hào)傳導(dǎo)通路還通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生存、分化和血管形成，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和耐藥方面發(fā)揮重要作用，也因此成為腫瘤干預(yù)治療的新靶點(diǎn)。 膽管癌主要指源于肝外膽管的惡性腫瘤，預(yù)后不佳。流行病學(xué)少見(jiàn)，國(guó)外尸檢發(fā)現(xiàn)率為0.01％～0.5％，占惡性腫瘤總數(shù)的3％，我國(guó)尸檢占0.07％～0.3％，其檢出率逐年增高。而臨床上對(duì)膽管癌的治療頗為棘手。進(jìn)一步探討PI3-K/Akt/PKB通路的調(diào)節(jié)以及與其他通路的交聯(lián)，提高對(duì)該通路在膽管

4、癌中的作用的認(rèn)識(shí)，有助于更好地理解其惡性行為，并針對(duì)該信號(hào)傳導(dǎo)通路尋找新的抗腫瘤藥物，對(duì)于膽管癌的治療將具有十分重要的意義。 在鄒聲泉教授的領(lǐng)導(dǎo)下，我們課題組在前期的研究中通過(guò)對(duì)膽管癌腫瘤生物學(xué)特性的研究有了深入的研究，認(rèn)識(shí)到膽管癌中有癌基因k-ras、c-erbB-2和c-myc,抑癌基因PTEN、p53、DPC4/Smad、p15和p16以及凋亡相關(guān)基因bcl-2和bax的突變、缺失或過(guò)表達(dá)，在肝外膽管癌的分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究

5、取得了很大的進(jìn)展，而我們也從前期研究的與膽管癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因出發(fā)，結(jié)合與腫瘤的形成、凋亡和轉(zhuǎn)移，并在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和耐藥方面發(fā)揮重要作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3K/AKT/PTEN/mTOR出發(fā)，對(duì)該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在膽管癌的凋亡及對(duì)化療增敏作用做出一些探討和研究。為肝外膽管癌的診斷和治療探討新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但由于時(shí)間的關(guān)系，我們的實(shí)驗(yàn)尚局限于較淺的層面，在今后的工作中我們將作進(jìn)一步深入研究。 第一部分：肝外膽管

6、癌mTOR、Akt和PTEN蛋白表達(dá) 論文1.肝外膽管癌mTOR、Akt和PTEN的表達(dá)及生物學(xué)意義 目的 研究PI3K/PTEN/AKT/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中mTOR、Akt和PTEN蛋白在膽管癌中的表達(dá)，及其在膽管癌發(fā)生，發(fā)展中的作用。 結(jié)論 1.PTEN較正常對(duì)照的膽管組織的高表達(dá)是降低的，而mTOR和Akt的表達(dá)是升高的； 2.PTEN和Akt、mTOR的關(guān)系密切，并呈負(fù)性相關(guān)，

7、說(shuō)明了PTEN的失活性，Akt和mTOR的低表達(dá)在膽管癌的生長(zhǎng)增殖中是有一定作用的，并且有密切的關(guān)系。 第二部分：PTEN-PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系 論文2.體外轉(zhuǎn)染PTEN抑制膽管癌QBC939細(xì)胞生長(zhǎng)及下調(diào)mTOR表達(dá)的研究 目的 研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3K/AKT/PTEN/mTOR中抑癌基因PTEN體外對(duì)膽管癌QBC939細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，及對(duì)下游mTOR表達(dá)的影響

8、。 結(jié)論 1.將攜帶有綠色熒光蛋白GFP的野生型PTEN導(dǎo)入QBC939細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的PTEN蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，磷酸化AKT的表達(dá)明顯降低；而轉(zhuǎn)染不具有磷酸酶活性的突變型PTEN的QBC939細(xì)胞雖然PTEN的表達(dá)也增強(qiáng)，但AKT的表達(dá)無(wú)明顯改變。說(shuō)明PTEN對(duì)腫瘤細(xì)胞的調(diào)控與脂質(zhì)酶的磷酸化有密切關(guān)系。 2.轉(zhuǎn)染前后腫瘤細(xì)胞的凋亡率有顯著意義的改變也提示PTEN可使細(xì)胞停滯于G1期。 3.轉(zhuǎn)染前后mTO

9、R相應(yīng)的改變說(shuō)明，PI3K/AKT/PTEN與mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系密切。 4.PTEN作為一種重要的抑癌基因?qū)δ懝馨┘?xì)胞體外作用有重要影響，其主要的機(jī)制可能是通過(guò)PI3K/AKT/PTEN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，作用于蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯有重要調(diào)控作用的關(guān)鍵產(chǎn)物mTOR，對(duì)其產(chǎn)生直接影響。 論文3.pcDNA3.1-mT0R表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 目的 構(gòu)建人mTOR基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-mTOR，并進(jìn)

10、行鑒定。方法 1.用RT-PCR法擴(kuò)增mTOR的全長(zhǎng)cDNA； 2.將空載質(zhì)粒pcDNA3.1和擴(kuò)增的mTOR用分別用HindⅢ和BamHI雙酶切，玻璃奶回收，純化，連接； 3.接種于LB培養(yǎng)基中，運(yùn)用酶切，進(jìn)行PCR鑒定； 4.DNA測(cè)序分析。 結(jié)論 通過(guò)RT-PCR法擴(kuò)增mTOR的全長(zhǎng)cDNA，將空載質(zhì)粒PCDNA3.1和擴(kuò)增的mTOR用分別用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，回收，純化，

11、連接，并運(yùn)用PCR鑒定，DNA測(cè)序分析，構(gòu)建成功人mTOR基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-mTOR。 論文4.pcDNA3.1-mTOR質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染膽管癌細(xì)胞 目的 研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路mTOR體外對(duì)膽管癌QBC939細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，及對(duì)抑癌基因PTEN的負(fù)反饋調(diào)節(jié)影響。 結(jié)論 1.轉(zhuǎn)染成功后，膽管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯增快，說(shuō)明mTOR的增高可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，為mTOR的特異性的抑制劑的運(yùn)用

12、提供了證據(jù)； 2.用攜帶有mTOR的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染QBC939細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的PTEN蛋白的表達(dá)增強(qiáng)；轉(zhuǎn)染前后PTEN的這種明顯的改變，說(shuō)明mTOR可能通過(guò)PI3K/AKT/PTEN與mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路負(fù)反饋調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)。 第三部分：rapamycin和LY294002對(duì)膽管癌細(xì)胞凋亡抑制作用和化療增敏作用的研究 論文5.磷酸化抑制劑對(duì)PI3K/AKT/PTEN/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用及對(duì)膽管癌化療增敏作

13、用的研究 目的 運(yùn)用磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑(phosphatidylinosito13-kinase，PI3-K)LY294002[22(42嗎啉基)282苯基24氫212苯并吡喃242酮]作用于膽管癌細(xì)胞系QBC939，探討抑制PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)膽管癌化療的增敏作用；并探討PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)膽管癌細(xì)胞的凋亡抑制作用。 結(jié)論 1.磷酸化抑制劑LY294002能有效的提高化療藥物5

14、-FU，MMC，CELECOXIB體外對(duì)QBC939細(xì)胞抑制作用的敏感性，通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制其激活來(lái)增強(qiáng)膽管癌細(xì)胞的化療效果 2.聯(lián)合運(yùn)用LY294002膽管癌細(xì)胞較單獨(dú)使用組凋亡率明顯增高，說(shuō)明抑制PI3K介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)膽管癌細(xì)胞的凋亡有抑制作用。 論文6.mTOR特異性抑制劑rapamycin抑制膽管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的研究 目的 運(yùn)用mTOR特異性抑制劑rapamycin作用于

15、膽管癌細(xì)胞系QBC939，探討抑制PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)膽管癌化療的增敏作用；同時(shí)探討PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)膽管癌細(xì)胞的凋亡抑制作用。 結(jié)論 1.mTOR特異性抑制劑rapamycin能有效的提高化療藥物5-FU，MMC，CELECOXIB體外對(duì)QBC939細(xì)胞抑制作用的敏感性，通過(guò)抑制mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制其活性來(lái)增強(qiáng)膽管癌細(xì)胞的化療效果 2.聯(lián)合運(yùn)用rapamycin膽管癌細(xì)胞較單獨(dú)使用組