PI3K-AKT-PTEN-mTOR信號轉導通路對膽管癌細胞凋亡抑制作用及化療增敏作用的研究.pdf

1、人體的整體功能上的協調統(tǒng)一是通過細胞與細胞間的相互識別、聯絡和相互作用而實現的，這種存在于細胞內和細胞間的識別、聯絡和相互作用，又在多個層次上具有交叉調控，形成了一個十分復雜的信號網絡系統(tǒng)。我們把細胞接受外界信號，通過一整套特定的機制，將胞外信號轉導為胞內信號，最終調節(jié)特定基因表達，并引起細胞的應答反應稱為細胞信號轉導。細胞的種種功能活動受到復雜的信號轉導通路的調控，精細調節(jié)的信號轉導是正常生命活動的前提，而信號轉導異常可以導致病理過程

2、。 許多研究表明，如果控制細胞增殖、分化的信息傳遞通路中某一環(huán)節(jié)異常，就會引起細胞生長失控，可以導致腫瘤形成或者腫瘤凋亡。在介導腫瘤細胞凋亡的眾多信號轉導途徑中，以PI3-K/Akt/PTEN/mTOR信號轉導途徑對凋亡的調節(jié)作用尤其重要。PI3-K/Akt/PTEN/mTOR信號傳導通路活化可以抑制多種刺激誘發(fā)的細胞凋亡，促進細胞周期進展，從而促進細胞的生存和增殖，同時參與血管形成，在腫瘤的形成中扮演重要角色，并參與腫瘤的侵襲

3、和轉移。而且該信號傳導通路還通過誘導腫瘤細胞生存、分化和血管形成，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和耐藥方面發(fā)揮重要作用，也因此成為腫瘤干預治療的新靶點。 膽管癌主要指源于肝外膽管的惡性腫瘤，預后不佳。流行病學少見，國外尸檢發(fā)現率為0.01％～0.5％，占惡性腫瘤總數的3％，我國尸檢占0.07％～0.3％，其檢出率逐年增高。而臨床上對膽管癌的治療頗為棘手。進一步探討PI3-K/Akt/PKB通路的調節(jié)以及與其他通路的交聯，提高對該通路在膽管

4、癌中的作用的認識，有助于更好地理解其惡性行為，并針對該信號傳導通路尋找新的抗腫瘤藥物，對于膽管癌的治療將具有十分重要的意義。 在鄒聲泉教授的領導下，我們課題組在前期的研究中通過對膽管癌腫瘤生物學特性的研究有了深入的研究，認識到膽管癌中有癌基因k-ras、c-erbB-2和c-myc,抑癌基因PTEN、p53、DPC4/Smad、p15和p16以及凋亡相關基因bcl-2和bax的突變、缺失或過表達，在肝外膽管癌的分子細胞遺傳學研究

5、取得了很大的進展，而我們也從前期研究的與膽管癌發(fā)生、發(fā)展和轉移相關的基因出發(fā)，結合與腫瘤的形成、凋亡和轉移，并在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和耐藥方面發(fā)揮重要作用的信號轉導通路PI3K/AKT/PTEN/mTOR出發(fā)，對該信號轉導通路在膽管癌的凋亡及對化療增敏作用做出一些探討和研究。為肝外膽管癌的診斷和治療探討新的理論基礎和實驗依據。但由于時間的關系，我們的實驗尚局限于較淺的層面，在今后的工作中我們將作進一步深入研究。 第一部分：肝外膽管

6、癌mTOR、Akt和PTEN蛋白表達 論文1.肝外膽管癌mTOR、Akt和PTEN的表達及生物學意義 目的 研究PI3K/PTEN/AKT/mTOR信號轉導通路中mTOR、Akt和PTEN蛋白在膽管癌中的表達，及其在膽管癌發(fā)生，發(fā)展中的作用。 結論 1.PTEN較正常對照的膽管組織的高表達是降低的，而mTOR和Akt的表達是升高的； 2.PTEN和Akt、mTOR的關系密切，并呈負性相關，

7、說明了PTEN的失活性，Akt和mTOR的低表達在膽管癌的生長增殖中是有一定作用的，并且有密切的關系。 第二部分：PTEN-PI3K/AKT信號轉導通路與mTOR信號轉導通路的關系 論文2.體外轉染PTEN抑制膽管癌QBC939細胞生長及下調mTOR表達的研究 目的 研究信號轉導通路PI3K/AKT/PTEN/mTOR中抑癌基因PTEN體外對膽管癌QBC939細胞生長的抑制作用，及對下游mTOR表達的影響

8、。 結論 1.將攜帶有綠色熒光蛋白GFP的野生型PTEN導入QBC939細胞中，發(fā)現細胞的PTEN蛋白的表達增強，磷酸化AKT的表達明顯降低；而轉染不具有磷酸酶活性的突變型PTEN的QBC939細胞雖然PTEN的表達也增強，但AKT的表達無明顯改變。說明PTEN對腫瘤細胞的調控與脂質酶的磷酸化有密切關系。 2.轉染前后腫瘤細胞的凋亡率有顯著意義的改變也提示PTEN可使細胞停滯于G1期。 3.轉染前后mTO

9、R相應的改變說明，PI3K/AKT/PTEN與mTOR信號轉導通路的關系密切。 4.PTEN作為一種重要的抑癌基因對膽管癌細胞體外作用有重要影響，其主要的機制可能是通過PI3K/AKT/PTEN信號轉導通路，作用于蛋白轉錄和翻譯有重要調控作用的關鍵產物mTOR，對其產生直接影響。 論文3.pcDNA3.1-mT0R表達質粒的構建及鑒定 目的 構建人mTOR基因的真核表達質粒pcDNA3.1-mTOR，并進

10、行鑒定。方法 1.用RT-PCR法擴增mTOR的全長cDNA； 2.將空載質粒pcDNA3.1和擴增的mTOR用分別用HindⅢ和BamHI雙酶切，玻璃奶回收，純化，連接； 3.接種于LB培養(yǎng)基中，運用酶切，進行PCR鑒定； 4.DNA測序分析。 結論 通過RT-PCR法擴增mTOR的全長cDNA，將空載質粒PCDNA3.1和擴增的mTOR用分別用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，回收，純化，

11、連接，并運用PCR鑒定，DNA測序分析，構建成功人mTOR基因的真核表達質粒pcDNA3.1-mTOR。 論文4.pcDNA3.1-mTOR質粒體外轉染膽管癌細胞 目的 研究信號轉導通路mTOR體外對膽管癌QBC939細胞生長的抑制作用，及對抑癌基因PTEN的負反饋調節(jié)影響。 結論 1.轉染成功后，膽管癌細胞的生長明顯增快，說明mTOR的增高可促進膽管癌細胞的生長，為mTOR的特異性的抑制劑的運用

12、提供了證據； 2.用攜帶有mTOR的質粒轉染QBC939細胞后，發(fā)現細胞的PTEN蛋白的表達增強；轉染前后PTEN的這種明顯的改變，說明mTOR可能通過PI3K/AKT/PTEN與mTOR信號轉導通路負反饋調節(jié)PTEN的表達。 第三部分：rapamycin和LY294002對膽管癌細胞凋亡抑制作用和化療增敏作用的研究 論文5.磷酸化抑制劑對PI3K/AKT/PTEN/mTOR信號轉導通路的作用及對膽管癌化療增敏作

13、用的研究 目的 運用磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑(phosphatidylinosito13-kinase，PI3-K)LY294002[22(42嗎啉基)282苯基24氫212苯并吡喃242酮]作用于膽管癌細胞系QBC939，探討抑制PI3K/AKT信號轉導通路對膽管癌化療的增敏作用；并探討PI3K/AKT信號轉導通路對膽管癌細胞的凋亡抑制作用。 結論 1.磷酸化抑制劑LY294002能有效的提高化療藥物5

14、-FU，MMC，CELECOXIB體外對QBC939細胞抑制作用的敏感性，通過抑制PI3K/AKT信號轉導通路，抑制其激活來增強膽管癌細胞的化療效果 2.聯合運用LY294002膽管癌細胞較單獨使用組凋亡率明顯增高，說明抑制PI3K介導的信號轉導通路對膽管癌細胞的凋亡有抑制作用。 論文6.mTOR特異性抑制劑rapamycin抑制膽管癌細胞生長的研究 目的 運用mTOR特異性抑制劑rapamycin作用于

15、膽管癌細胞系QBC939，探討抑制PI3K/AKT信號轉導通路對膽管癌化療的增敏作用；同時探討PI3K/AKT信號轉導通路對膽管癌細胞的凋亡抑制作用。 結論 1.mTOR特異性抑制劑rapamycin能有效的提高化療藥物5-FU，MMC，CELECOXIB體外對QBC939細胞抑制作用的敏感性，通過抑制mTOR信號轉導通路，抑制其活性來增強膽管癌細胞的化療效果 2.聯合運用rapamycin膽管癌細胞較單獨使用組