無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)中國對(duì)蝦抗菌肽基因水稻的獲得及其遺傳分析和抗病檢測(cè).pdf

1、抗菌肽Antimicrobial peptides, AMPs具有廣譜殺菌作用和不易引起病原微生物產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，可以顯著提高動(dòng)植物的抗病能力。本研究利用雙 T-DNA載體系統(tǒng)將中國對(duì)蝦抗菌肽基因DP3和選擇標(biāo)記基因HPT導(dǎo)入到水稻恢復(fù)系明恢86中，以期獲得不含篩選標(biāo)記，抗病性顯著增強(qiáng)的轉(zhuǎn)抗菌肽基因水稻。
　　前期工作中我們通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化共獲得了110個(gè)T0代轉(zhuǎn)基因植株。本研究分析了外源基因DP3和潮霉素抗性基

2、因HPT在T1代轉(zhuǎn)基因植株中的分離情況，獲得了只含目的基因不含篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株；檢測(cè)了部分轉(zhuǎn)DP3基因植株對(duì)白葉枯病和紋枯病的抗病能力。最終獲得無選擇標(biāo)記的抗病轉(zhuǎn)DP3基因水稻。主要研究結(jié)果如下：
　　1.植物雙T-DNA表達(dá)載體dph3轉(zhuǎn)化水稻明恢86，獲得110株T0代轉(zhuǎn)DP3基因植株。對(duì)所有 T1代轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行潮霉素抗性檢測(cè)，結(jié)果顯示，有97個(gè)株系出現(xiàn)抗性和敏感分離，占總株系的88.2％，其中78個(gè)株系符合3:1或15

3、:1的分離比，19個(gè)株系不符合孟德爾分離定律。另外，還有13個(gè)株系所有植株均對(duì)潮霉素敏感，占總株系的11.8%。
　　2.對(duì)10個(gè)潮霉素抗感符合分離定律的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行單株 PCR檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)分析選擇標(biāo)記基因HPT和目的基因DP3在T1代的遺傳規(guī)律。結(jié)果顯示，兩個(gè)基因在3個(gè)株系中自由組合，4個(gè)株系出現(xiàn)連鎖。另外2個(gè)株系中的DP3基因不符合孟德爾的遺傳分離定律，1個(gè)株系沒檢測(cè)到目的基因DP3。在468個(gè)檢測(cè)單株中篩選出31個(gè)無選擇標(biāo)記

4、的轉(zhuǎn)基因植株，約占總樣本的6.6%。
　　3. T1代轉(zhuǎn)基因植株RT-PCR檢測(cè)表明，抗菌肽基因DP3在mRNA水平上得到表達(dá)。DP3在株系E46中的表達(dá)量高于其他株系。
　　4.抗病檢測(cè)表明，用白葉枯病小種PXO86、PXO99和紋枯病小種GD-118、C-30對(duì)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行接種。與陰性對(duì)照相比，無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因陽性植株對(duì)水稻白葉枯病和紋枯病的抗性明顯增強(qiáng)。無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因陽性植株的白葉枯病的病斑比值較為穩(wěn)定，一般在20%以