抗菌肽基因MSI-99t在馬鈴薯中表達(dá)增強(qiáng)了植株抗病性.pdf

1、馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)是一種重要的糧食作物，其生產(chǎn)規(guī)模僅次于水稻、小麥和玉米居第四位。馬鈴薯產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富、適應(yīng)能力強(qiáng)，又是一種糧菜兼用型作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人民生活中占有極其重要的地位。馬鈴薯在田間生長過程中，易遭受各種病害(如晚疫病、青枯病等)的威脅，引起產(chǎn)量和品質(zhì)的下降，常常造成巨大的損失。目前人們對這些病害尚無有效的防治方法，培育優(yōu)良抗病品種是減少損失的根本途徑。
　　 Magainin為來源

2、于非洲爪蛙皮膚中分離的具有廣譜抗性的抗菌肽，對多種植物病原菌、真菌及病毒均有強(qiáng)烈抑制作用。MSI-99作為人工修飾后的magaininⅡ，它消除了對植物蛋白酶的敏感位點(diǎn)，因而能在植物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)而不被植物蛋白酶降解。本研究根據(jù)MSI-99的氨基酸序列合成了具有馬鈴薯偏好性的MSI-99t基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將MSI-99t基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯栽培品種Désirée中。研究結(jié)果如下：
　　 1.轉(zhuǎn)MSI-99t基因馬鈴薯植株再生。以

3、馬鈴薯品種Désirée的莖段為外植體，將外植體黑暗預(yù)培養(yǎng)2d，農(nóng)桿菌侵染5-8 min，黑暗共培養(yǎng)2d，轉(zhuǎn)入愈傷誘導(dǎo)和芽分化的培養(yǎng)基(MS+0.5 mg/L TDZ+0.3 mg/L GA3+50 mg/L Kan+200 mg/L Cef)。光照培養(yǎng)3-4周即有不定芽的生成，對產(chǎn)生的不定芽通過Kan(100 mg/L)生根篩選，共得到了15個(gè)Kan抗性株系。對15個(gè)kan抗性植株P(guān)CR檢測，獲得8株陽性植株。經(jīng)Southern雜交驗(yàn)

4、證，有5株出現(xiàn)雜交信號(hào)，其中有2株含單拷貝，2株含雙拷貝，1株含三拷貝、表明MSI-99t基因已經(jīng)整合到再生植株基因組中。
　　 2.MSI-99t基因的表達(dá)分析。采用RT-PCR和Q-RT-PCR分析了轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中MSI-99t基因的空間表達(dá)。MSI-99t基因在轉(zhuǎn)基因植株的所有器官中都有表達(dá)，在葉片和芽中表達(dá)量較高，莖段和根中亦有少量表達(dá)。在轉(zhuǎn)基因株系之間 MSI-99t基因的表達(dá)量存在差異，推測與目的基因的拷貝數(shù)和位置效

5、應(yīng)有關(guān)。
　　 3.轉(zhuǎn)基因株系對黃萎病菌的抗性分析。將轉(zhuǎn)基因植株及其對照經(jīng)煉苗后移入溫室中，分別取生長6周左右的各轉(zhuǎn)基因株系葉片，提取總蛋白進(jìn)行大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，與對照植株相比，轉(zhuǎn)基因植株蛋白提取物對大麗輪枝菌有更強(qiáng)的抑制作用，在轉(zhuǎn)基因株系之間抑制效果存在差異。
　　 4.轉(zhuǎn)基因株系對青枯病菌的抗性分析。將離體的轉(zhuǎn)基因和野生型馬鈴薯莖枝浸泡在濃度為106/ml

6、的青枯病菌(Ralstonia Solanacearum)中，逐天調(diào)查發(fā)病期和嚴(yán)重度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系對青枯病菌的抗性得到明顯增強(qiáng)，病情指數(shù)比對照降低60％，發(fā)病明顯延遲，部分株系達(dá)到抗病(R)水平?？共∷皆谵D(zhuǎn)基因株系之間存在較大差異，推測與MSI-99t基因在各株系中表達(dá)量的差異有關(guān)。
　　 5.轉(zhuǎn)基因株系對晚疫病菌的抗性分析。采用離體葉片接種法和活體接種法，將致病疫霉(Phytophthora infestans)