HCMVAD169突變株體外感染小鼠胚胎成纖維細胞及其基因變異的研究.pdf

1、目的:通過HCMV(human cytomegalovirus)AD169突變株體外感染小鼠胚胎成纖維細胞,并對其UL55、UL74和UL75基因進行變異分析,研究其在病毒跨種屬感染中的可能作用,為探索HCMV跨種屬感染機制提供線索。
　　方法:將本實驗室HCMV AD169突變株和HCMV臨床分離株復蘇增殖后采用TCID50法滴定病毒感染劑量。以100 TCID50的劑量接種至BALB/c小鼠胚胎成纖維細胞(MF)和人胚胎成纖維

2、細胞(HF),逐日鏡下觀察并進行如下檢測:(1)觀察HCMV特征性細胞病變效應(CPE);待出現(xiàn)明顯CPE后,采用PCR和RT-PCR法分別檢測 HCMV特異性基因IE和UL83的復制和轉錄。(2)采用HCMV pp65蛋白特異性單克隆抗體直接免疫熒光檢測細胞中HCMV pp65蛋白的表達。(3)在感染后第30min、1h、2h、4h、8h、24h、2d和第5d,分別收集細胞培養(yǎng)物,提取DNA,采用熒光定量PCR法檢測病毒拷貝數(shù)驗證HC

3、MV增殖動力學。(4)在感染后第1d、3d和第5d,分別使用HCMV IE-1、MCP和gB單抗進行間接免疫熒光檢測,以進一步確定HCMV增殖狀態(tài)。(5)對HCMV AD169突變株和臨床分離株提取DNA進行 UL55、UL74和 UL75基因全長的PCR擴增并測序,將得到的序列與皰疹病毒科的其他代表毒株以及小鼠巨細胞病毒(MCMV)進行比對,經MEGA5.0軟件分析繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。
　　結果:以100 TCID50的劑量將HCM

4、V AD169突變株和臨床分離株分別接種至MF細胞和HF細胞后結果如下:(1)可觀察到HCMV AD169突變株接種MF細胞出現(xiàn)病毒所致CPE,與HF細胞上的CPE相似,表現(xiàn)為細胞腫脹變圓,胞內顆粒增多,折光性增強。將培養(yǎng)物連續(xù)傳代三次,仍然可觀察到明顯CPE。細胞培養(yǎng)物經PCR、RT-PCR法檢測HCMV UL83、IE基因及其轉錄產物均陽性。(2)經pp65直接免疫熒光染色,在MF和HF細胞胞漿內均可見蘋果綠色陽性信號,病毒pp65

5、蛋白可在感染的兩種細胞中表達。HCMV臨床分離株接種MF細胞不出現(xiàn)CPE,細胞培養(yǎng)物經PCR、RT-PCR法檢測HCMV UL83、IE基因及其轉錄產物均陰性,在MF細胞胞漿內無蘋果綠色陽性信號。接種HF細胞后出現(xiàn)CPE,表現(xiàn)為細胞腫脹變圓,胞內顆粒增多,折光性增強。細胞培養(yǎng)物經PCR、RT-PCR法檢測HCMV UL83、IE基因及其轉錄產物均陽性。經pp65直接免疫熒光染色,在HF細胞胞漿內可見蘋果綠色陽性信號。(3)采用熒光定量P

6、CR法檢測病毒拷貝數(shù)驗證HCMV增殖動力學的結果顯示,HF與MF細胞在接種HCMV AD169突變株后的6h內,病毒DNA拷貝數(shù)波動均上升;但在感染后6-8h,病毒DNA拷貝數(shù)大幅降低;在感染后8h-5d,病毒DNA拷貝數(shù)持續(xù)上升。比較HCMV AD169突變株在HF細胞、MF細胞上的病毒DNA拷貝數(shù)變化,可以發(fā)現(xiàn)HCMV AD169突變株在接種MF細胞后第30min,其病毒拷貝數(shù)為100.56±0.01copies/100ng·DNA

7、,與接種 HF細胞后第30min(100.54±0.02copies/100ng·DNA)無顯著差異,但在接種后第1h、2h、4h、6h、8h、16h、1d、2d和第5d,MF細胞上的病毒拷貝數(shù)均低于其在HF細胞上的拷貝數(shù),且差異具有顯著性(P<0.05)。HCMV臨床分離株在接種HF細胞后各檢測時間點,病毒DNA拷貝數(shù)與HCMV AD169突變株在HF細胞的病毒DNA拷貝數(shù)變化相似,除接種后第6h(101.35±0.11copies)

8、和第1d(101.32±0.08copies)病毒DNA拷貝數(shù)低于HCMV AD169突變株在HF細胞上相應時間點的病毒DNA拷貝數(shù)(101.59±0.12copies和101.52±0.14copies)且差異顯著外,其他各時間點病毒DNA拷貝數(shù)與HCMV AD169突變株相應時間點的病毒DNA拷貝數(shù)比較均無顯著差異。HCMV臨床分離株在接種MF細胞后第1h病毒DNA拷貝數(shù)出現(xiàn)顯著下降,在此后的時間點內均未顯著上升,除接種后第30mi

9、n(100.55±0.02copies)病毒DNA拷貝數(shù)與HCMV AD169突變株在MF細胞(100.56±0.01copies)和HF細胞(100.54±0.02copies)上相應時間點的病毒 DNA拷貝數(shù)無顯著差異外,其它各時間點均顯著低于HCMV AD169突變株在MF細胞和HF細胞上相應時間點的病毒DNA拷貝數(shù)。HCMV AD169突變株在MF細胞增殖趨勢與其在HF細胞上的增殖趨勢相似,均呈上升趨勢,但病毒在MF細胞上的增殖

10、速率略低于其在HF細胞上的增殖速率;HCMV臨床分離株在MF細胞上不增殖。(4)采用HCMV IE-1、MCP和gB單抗進行間接免疫熒光檢測觀察感染后不同時間點細胞感染狀況的結果發(fā)現(xiàn),HCMV AD169突變株在感染HF細胞后,第1天即可在感染細胞細胞核內檢測到IE陽性信號,第3天IE陽性信號明顯加強,第5天IE陽性信號略有減弱,而MCP陽性信號出現(xiàn)在第3天的感染細胞細胞核內,gB出現(xiàn)陽性信號出現(xiàn)在第3天的感染細胞胞漿內,隨感染時間延長

11、,第5天MCP、gB陽性信號進一步加強。與感染HF比較,HCMV AD169突變株感染MF細胞后,第1天視野中無任何陽性信號出現(xiàn);第3天才在感染細胞細胞核內出現(xiàn)IE陽性信號和較弱的MCP陽性信號,胞漿內無gB陽性信號出現(xiàn);隨感染時間延長,第5天感染細胞細胞核內IE、MCP陽性信號明顯加強,感染細胞胞漿內有弱gB陽性信號出現(xiàn),除感染后第5天IE陽性信號強于HF細胞外,其他各時間點陽性信號均較HF細胞感染后弱。而HCMV臨床分離株接種MF細

12、胞后直到感染后第5天仍無任何陽性信號檢出,HCMV臨床分離株接種HF細胞后第5天,感染細胞細胞核內有明顯IE、MCP陽性信號,感染細胞胞漿內有明顯gB陽性信號。說明HCMV AD169突變株可感染MF細胞,且在感染細胞中有病毒蛋白表達,但病毒蛋白表達時間與感染HF細胞有所差異;提示HCMV臨床分離株不能感染MF細胞。(5)HCMV AD169突變株UL55、UL74和UL75基因序列經Clustal W軟件比對分析后發(fā)現(xiàn): UL74、U

13、L75基因及其編碼氨基酸序列與Genebank公布的HCMV標準株相應序列的同源性為100％,UL55基因及其編碼氨基酸序列的同源性在99%~100%之間。在本研究中,能夠感染小鼠胚胎成纖維細胞的HCMV AD169突變株UL55基因的83094位點由G突變?yōu)锳,83106位點由G突變?yōu)镃,83114位點由C突變?yōu)锳,83119位點由A突變?yōu)镚,83281位點由A突變?yōu)镚,導致第133位氨基酸發(fā)生了天冬酰胺到天冬氨酸的突變,第127位氨

14、基酸由谷氨酰胺到組氨酸的突變,第125位氨基酸由甘氨酸到天冬氨酸的突變,第71位氨基酸由谷氨酸到天冬氨酸的突變。經MEGA5.0軟件繪制系統(tǒng)進化樹后發(fā)現(xiàn):能夠感染小鼠胚胎成纖維細胞的HCMV,其UL55基因在進化樹上與宿主廣泛的HSV-1一起處在另一獨立的支群內。
　　結論:
　　(1)實驗證實我室HCMV AD169突變株在體外培養(yǎng)的小鼠胚胎成纖維細胞中呈增殖性感染。此為進一步開展HCMV跨種屬研究奠定了基礎。