HCMVAD169突變株體外感染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞及其基因變異的研究.pdf

1、目的:通過HCMV(human cytomegalovirus)AD169突變株體外感染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,并對其UL55、UL74和UL75基因進(jìn)行變異分析,研究其在病毒跨種屬感染中的可能作用,為探索HCMV跨種屬感染機(jī)制提供線索。
　　方法:將本實(shí)驗(yàn)室HCMV AD169突變株和HCMV臨床分離株復(fù)蘇增殖后采用TCID50法滴定病毒感染劑量。以100 TCID50的劑量接種至BALB/c小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MF)和人胚胎成纖維

2、細(xì)胞(HF),逐日鏡下觀察并進(jìn)行如下檢測:(1)觀察HCMV特征性細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE);待出現(xiàn)明顯CPE后,采用PCR和RT-PCR法分別檢測 HCMV特異性基因IE和UL83的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。(2)采用HCMV pp65蛋白特異性單克隆抗體直接免疫熒光檢測細(xì)胞中HCMV pp65蛋白的表達(dá)。(3)在感染后第30min、1h、2h、4h、8h、24h、2d和第5d,分別收集細(xì)胞培養(yǎng)物,提取DNA,采用熒光定量PCR法檢測病毒拷貝數(shù)驗(yàn)證HC

3、MV增殖動力學(xué)。(4)在感染后第1d、3d和第5d,分別使用HCMV IE-1、MCP和gB單抗進(jìn)行間接免疫熒光檢測,以進(jìn)一步確定HCMV增殖狀態(tài)。(5)對HCMV AD169突變株和臨床分離株提取DNA進(jìn)行 UL55、UL74和 UL75基因全長的PCR擴(kuò)增并測序,將得到的序列與皰疹病毒科的其他代表毒株以及小鼠巨細(xì)胞病毒(MCMV)進(jìn)行比對,經(jīng)MEGA5.0軟件分析繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。
　　結(jié)果:以100 TCID50的劑量將HCM

4、V AD169突變株和臨床分離株分別接種至MF細(xì)胞和HF細(xì)胞后結(jié)果如下:(1)可觀察到HCMV AD169突變株接種MF細(xì)胞出現(xiàn)病毒所致CPE,與HF細(xì)胞上的CPE相似,表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹變圓,胞內(nèi)顆粒增多,折光性增強(qiáng)。將培養(yǎng)物連續(xù)傳代三次,仍然可觀察到明顯CPE。細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)PCR、RT-PCR法檢測HCMV UL83、IE基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物均陽性。(2)經(jīng)pp65直接免疫熒光染色,在MF和HF細(xì)胞胞漿內(nèi)均可見蘋果綠色陽性信號,病毒pp65

5、蛋白可在感染的兩種細(xì)胞中表達(dá)。HCMV臨床分離株接種MF細(xì)胞不出現(xiàn)CPE,細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)PCR、RT-PCR法檢測HCMV UL83、IE基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物均陰性,在MF細(xì)胞胞漿內(nèi)無蘋果綠色陽性信號。接種HF細(xì)胞后出現(xiàn)CPE,表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹變圓,胞內(nèi)顆粒增多,折光性增強(qiáng)。細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)PCR、RT-PCR法檢測HCMV UL83、IE基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物均陽性。經(jīng)pp65直接免疫熒光染色,在HF細(xì)胞胞漿內(nèi)可見蘋果綠色陽性信號。(3)采用熒光定量P

6、CR法檢測病毒拷貝數(shù)驗(yàn)證HCMV增殖動力學(xué)的結(jié)果顯示,HF與MF細(xì)胞在接種HCMV AD169突變株后的6h內(nèi),病毒DNA拷貝數(shù)波動均上升;但在感染后6-8h,病毒DNA拷貝數(shù)大幅降低;在感染后8h-5d,病毒DNA拷貝數(shù)持續(xù)上升。比較HCMV AD169突變株在HF細(xì)胞、MF細(xì)胞上的病毒DNA拷貝數(shù)變化,可以發(fā)現(xiàn)HCMV AD169突變株在接種MF細(xì)胞后第30min,其病毒拷貝數(shù)為100.56±0.01copies/100ng·DNA

7、,與接種 HF細(xì)胞后第30min(100.54±0.02copies/100ng·DNA)無顯著差異,但在接種后第1h、2h、4h、6h、8h、16h、1d、2d和第5d,MF細(xì)胞上的病毒拷貝數(shù)均低于其在HF細(xì)胞上的拷貝數(shù),且差異具有顯著性(P<0.05)。HCMV臨床分離株在接種HF細(xì)胞后各檢測時間點(diǎn),病毒DNA拷貝數(shù)與HCMV AD169突變株在HF細(xì)胞的病毒DNA拷貝數(shù)變化相似,除接種后第6h(101.35±0.11copies)

8、和第1d(101.32±0.08copies)病毒DNA拷貝數(shù)低于HCMV AD169突變株在HF細(xì)胞上相應(yīng)時間點(diǎn)的病毒DNA拷貝數(shù)(101.59±0.12copies和101.52±0.14copies)且差異顯著外,其他各時間點(diǎn)病毒DNA拷貝數(shù)與HCMV AD169突變株相應(yīng)時間點(diǎn)的病毒DNA拷貝數(shù)比較均無顯著差異。HCMV臨床分離株在接種MF細(xì)胞后第1h病毒DNA拷貝數(shù)出現(xiàn)顯著下降,在此后的時間點(diǎn)內(nèi)均未顯著上升,除接種后第30mi

9、n(100.55±0.02copies)病毒DNA拷貝數(shù)與HCMV AD169突變株在MF細(xì)胞(100.56±0.01copies)和HF細(xì)胞(100.54±0.02copies)上相應(yīng)時間點(diǎn)的病毒 DNA拷貝數(shù)無顯著差異外,其它各時間點(diǎn)均顯著低于HCMV AD169突變株在MF細(xì)胞和HF細(xì)胞上相應(yīng)時間點(diǎn)的病毒DNA拷貝數(shù)。HCMV AD169突變株在MF細(xì)胞增殖趨勢與其在HF細(xì)胞上的增殖趨勢相似,均呈上升趨勢,但病毒在MF細(xì)胞上的增殖

10、速率略低于其在HF細(xì)胞上的增殖速率;HCMV臨床分離株在MF細(xì)胞上不增殖。(4)采用HCMV IE-1、MCP和gB單抗進(jìn)行間接免疫熒光檢測觀察感染后不同時間點(diǎn)細(xì)胞感染狀況的結(jié)果發(fā)現(xiàn),HCMV AD169突變株在感染HF細(xì)胞后,第1天即可在感染細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)檢測到IE陽性信號,第3天IE陽性信號明顯加強(qiáng),第5天IE陽性信號略有減弱,而MCP陽性信號出現(xiàn)在第3天的感染細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi),gB出現(xiàn)陽性信號出現(xiàn)在第3天的感染細(xì)胞胞漿內(nèi),隨感染時間延長

11、,第5天MCP、gB陽性信號進(jìn)一步加強(qiáng)。與感染HF比較,HCMV AD169突變株感染MF細(xì)胞后,第1天視野中無任何陽性信號出現(xiàn);第3天才在感染細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)IE陽性信號和較弱的MCP陽性信號,胞漿內(nèi)無gB陽性信號出現(xiàn);隨感染時間延長,第5天感染細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)IE、MCP陽性信號明顯加強(qiáng),感染細(xì)胞胞漿內(nèi)有弱gB陽性信號出現(xiàn),除感染后第5天IE陽性信號強(qiáng)于HF細(xì)胞外,其他各時間點(diǎn)陽性信號均較HF細(xì)胞感染后弱。而HCMV臨床分離株接種MF細(xì)

12、胞后直到感染后第5天仍無任何陽性信號檢出,HCMV臨床分離株接種HF細(xì)胞后第5天,感染細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)有明顯IE、MCP陽性信號,感染細(xì)胞胞漿內(nèi)有明顯gB陽性信號。說明HCMV AD169突變株可感染MF細(xì)胞,且在感染細(xì)胞中有病毒蛋白表達(dá),但病毒蛋白表達(dá)時間與感染HF細(xì)胞有所差異;提示HCMV臨床分離株不能感染MF細(xì)胞。(5)HCMV AD169突變株UL55、UL74和UL75基因序列經(jīng)Clustal W軟件比對分析后發(fā)現(xiàn): UL74、U

13、L75基因及其編碼氨基酸序列與Genebank公布的HCMV標(biāo)準(zhǔn)株相應(yīng)序列的同源性為100％,UL55基因及其編碼氨基酸序列的同源性在99%~100%之間。在本研究中,能夠感染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的HCMV AD169突變株UL55基因的83094位點(diǎn)由G突變?yōu)锳,83106位點(diǎn)由G突變?yōu)镃,83114位點(diǎn)由C突變?yōu)锳,83119位點(diǎn)由A突變?yōu)镚,83281位點(diǎn)由A突變?yōu)镚,導(dǎo)致第133位氨基酸發(fā)生了天冬酰胺到天冬氨酸的突變,第127位氨

14、基酸由谷氨酰胺到組氨酸的突變,第125位氨基酸由甘氨酸到天冬氨酸的突變,第71位氨基酸由谷氨酸到天冬氨酸的突變。經(jīng)MEGA5.0軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹后發(fā)現(xiàn):能夠感染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的HCMV,其UL55基因在進(jìn)化樹上與宿主廣泛的HSV-1一起處在另一獨(dú)立的支群內(nèi)。
　　結(jié)論:
　　(1)實(shí)驗(yàn)證實(shí)我室HCMV AD169突變株在體外培養(yǎng)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中呈增殖性感染。此為進(jìn)一步開展HCMV跨種屬研究奠定了基礎(chǔ)。