人巨細胞病毒感染對人胚肺成纖維細胞周期及復制前復合物的影響.pdf

1、目的:研究人巨細胞病毒(HCMV)感染人胚肺成纖維細胞(HELF)后對其細胞周期及復制前復合物(pre-RC)的影響。探討HCMV感染的發(fā)病機制。 方法: 1、血清饑餓法同步化HELF于G0/G1期，用HCMV感染同步化的HELF作為感染組(細胞數(shù)=1×106)，同時設模擬感染組為對照組(細胞數(shù)=1×106)。用倒置相差顯微鏡觀察兩組細胞形態(tài)學變化至感染后7天，于感染后12、24、48、72和96小時收獲細胞。

2、2、流式細胞儀檢測HELF細胞周期。 3、免疫細胞化學法檢測兩組HELF細胞核內HCMVIE172蛋白，Cdt1蛋白水平。 4、提取總RNA，用半定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測兩組HELF復制前復合物Cdt1 mRNA、Cdc6 mRNA、Mcm2 mRNA、Mcm8 mRNA的表達水平。 5、RT-PCR法檢測兩組HELF復制抑制因子Geminin的表達水平。 結果: 1、兩組HE

3、LF細胞形態(tài)學變化：感染組HELF感染后72h時即可見局部細胞變圓，膨脹，細胞體及細胞核巨大化，7天時可見所有細胞均發(fā)生病變；模擬感染組HELF各時間點均未見細胞形態(tài)學改變。 2、兩組HELF HCMVIE172蛋白陽性產物表達：感染組HELF于感染后12h時細胞核內即出現(xiàn)呈棕黃色顆粒的HCMVIE172蛋白產物的表達；模擬感染組HELF各時間點均未出現(xiàn)HCMVIE172蛋白陽性產物。 3、兩組HELF細胞周期檢測結果：

4、感染組在感染后12h時有70.4％的細胞處于G1期，24h時有69.9％的細胞處于G1期；模擬感染組在感染后12h時有65.7％的細胞處于G1期，24h時有43.8％的細胞處于G1期。感染組HELF停滯G1期于較模擬感染組明顯增多，兩組比較，差異均有統(tǒng)計學意義。 4、兩組HELF Cdt1 mRNA表達水平：模擬感染組在感染后12h時Cdt1 mRNA表達水平最高，后逐漸下降，至72h時達最低水平，96h時又稍有回升。感染組在感

5、染后12h時Cdt1 mRNA表達水平較低，24h時稍有升高，48h達最高峰，72h時開始下降，96h時大致維持72h水平。兩組比較，12h、24h和48h時Cdt1 mRNA表達水平差異均有統(tǒng)計學意義，12h和24h時感染組較模擬感染組明顯降低，48h時感染組較模擬感染組明顯升高。模擬感染組Cdt1 mRNA表達水平的高峰出現(xiàn)在感染后12h，而感染組的高峰則出現(xiàn)在感染后48h，較模擬感染組明顯滯后。 5、兩組HELF Cdt1

6、蛋白水平：12h、24h、和96h時兩組HELF Cdt1蛋白水平差異均有統(tǒng)計學意義，48h、72h時兩組HELF Cdt1蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義。12h和96h時感染組較模擬感染組明顯降低，24h時感染組較模擬感染組明顯升高。模擬感染組在感染后12h時Cdt1蛋白表達水平最高，后逐漸下降，至24h時達最低水平，96h時又稍有回升；感染組在感染后12h時Cdt1蛋白表達水平較低，24h時達到最高峰，48h時急劇下降，一直維持較低的穩(wěn)定

7、水平。 6、兩組HELF Cdc6 mRNA表達水平：12h、24h、48h、72h和96h時兩組HELF Cdc6 mRNA表達水平差異均有統(tǒng)計學意義，12h、24h和48h時感染組較模擬感染組明顯增加，72h和96h時模擬感染組較感染組明顯升高。感染組在感染后12h時Cdc6 mRNA表達水平最高，后逐漸下降，至72h時達最低水平，96h時又稍有回升；模擬感染組在感染12h時Cdc6 mRNA表達水平最高，后逐漸下降，至48

8、h時達最低水平，72h后開始回升，96h時繼續(xù)回升。 7、兩組HELF Mcm2 mRNA、Mcm8 mRNA表達水平：12h、24h、48h、72h、96h時兩組HELF Mcm2 mRNA、Mcm8mRNA表達水平差異均有統(tǒng)計學意義，12h和24h時感染組表達水平低于模擬感染組，48h、72h、96h時感染組表達水平明顯高于模擬感染組。模擬感染組Mcm2 mRNA、Mcm8 mRNA表達水平的高峰出現(xiàn)在感染后24h，而感染組

9、表達水平的高峰則出現(xiàn)在感染后48h，較模擬感染組有明顯滯后。 8、兩組HELF Geminin mRNA表達水平：12h、24h、48h和72h時兩組HELF Geminin mRNA表達水平差異均有統(tǒng)計學意義，12h和24h時感染組較模擬感染組明顯增加，48h和72h時感染組較模擬感染組明顯降低。感染組在感染后12h時Geminin mRNA表達水平最高，模擬感染組在感染后48h達最高峰。 結論: 1、人巨細胞

10、病毒感染人胚肺成纖維細胞后在其細胞核內進行復制、增殖。 2、人巨細胞病毒感染阻滯了人胚肺成纖維細胞周期，使大部分細胞停滯在G1期。 3、人巨細胞病毒IE172蛋白的表達提示人巨細胞病毒的早期感染。 4、人巨細胞病毒感染使人胚肺成纖維細胞復制前復合物主要成份Cdt1 mRNA、Mcm2 mRNA、Mcm8 mRNA的表達水平遲滯、Cdt1蛋白表達延遲。Cdc6 mRNA高水平表達。 5、人巨細胞病毒感染能誘