NF-κB-HIF-1α誘導(dǎo)乏氧人肺腺癌細胞順鉑耐藥及EGCG增敏作用初探.pdf

1、背景：肺腺癌是非小細胞肺癌的一種病理類型。目前，其發(fā)病率在世界許多國家和地區(qū)均呈顯著上升趨勢。肺腺癌具有早期遠處轉(zhuǎn)移的特點。因此，以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化學(xué)是其主要的治療方法。然而，由于鉑類藥物耐藥及毒性作用，常導(dǎo)致化療失敗。腫瘤細胞耐藥機制復(fù)雜。近年來，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤乏氧微環(huán)境可能是誘導(dǎo)細胞化療耐藥的始動因素。
　　局部組織乏氧是實體瘤的特征之一。乏氧使腫瘤細胞內(nèi)HIF-1α表達增多。HIF-1α是目前介導(dǎo)細胞缺氧反應(yīng)最關(guān)鍵的特異性轉(zhuǎn)

2、錄因子，對多種缺氧反應(yīng)基因具有轉(zhuǎn)錄激活作用，不僅與細胞乏氧環(huán)境中的適應(yīng)性生存密切相關(guān)，而且通過上調(diào)多藥耐藥蛋白及凋亡抑制蛋白的表達誘導(dǎo)腫瘤細胞化療耐藥，是目前研究乏氧條件下腫瘤化、放療耐藥的熱點及逆轉(zhuǎn)化、放療耐藥的靶點。然而，隨著對腫瘤乏氧微環(huán)境及HIF-1α研究的日臻深入，發(fā)現(xiàn)NF-κB在乏氧環(huán)境中被異常激活，而且在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個水平上調(diào)控HIF-1α的表達。據(jù)此，我們推測抑制NF-κB的激活有望通過下調(diào)HIF-1α及其通路的表達成為

3、逆轉(zhuǎn)乏氧條件下腫瘤細胞化療耐藥的新靶點。同時，尋找一種天然的、安全的物質(zhì)逆轉(zhuǎn)乏氧誘導(dǎo)的化療耐藥成為當務(wù)之急。
　　目的：探討乏氧條件下人肺腺癌細胞中NF-κB、HIF-1α的表達對化療敏感性的影響以及EGCG能否逆轉(zhuǎn)細胞化療耐藥及可能機制。
　　方法：采用CoCl2構(gòu)建離體人肺腺癌A549細胞化學(xué)乏氧模型。第一部分:人肺腺癌A549細胞分為常氧對照組（control組）、CoCl2(100、200uM)實驗組。細胞免疫組織化

4、學(xué)及Western blot檢測各組A549細胞HIF-1α的表達;光鏡、電鏡觀察各組A549細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu);MTT法繪制各組A549細胞生長曲線;流式細胞儀檢測各組A549細胞周期分布;MTT法檢測各組A549細胞順鉑IC50;Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測順鉑誘導(dǎo)各組A549細胞的凋亡率。第二部分:人肺腺癌A549細胞分為常氧對照組（control組）、200uM CoCl2乏氧組（COCl2組）。首先，通過

5、免疫熒光細胞化學(xué)、Real-timePCR、Western-blot等技術(shù)檢測人肺腺癌A549細胞NF-κBp65、HIF-1α的表達;然后，常氧條件下通過陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000瞬時轉(zhuǎn)染A549細胞p65-siRNA、FITC-conjugated control-siRNA或加入 HIF-1α特異性抑制劑YC-1，再于200uM CoCl2化學(xué)乏氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)。 A549細胞分為空白對照組（control

6、組）、200uM CoCl2乏氧組（CoCl2組）、p65-SiRNA+200uM CoCl2(p65-siRNA組)、Control-siRNA+200uM CoCl2乏氧組（Control-siRNA組）、Lip+200uMCoCl2乏氧組（Lip組）及YC-1+200uM CoCl2乏氧組（YC-1組），通過Real-timePCR、Western-blot等技術(shù)檢測人肺腺癌A549細胞NF-κBp65、HIF-1α的表達。第三部

7、分:人肺腺癌A549細胞分為常氧對照組（control組）、200uM CoCl2乏氧組（CoCl2組）、p65-SiRNA+200uM CoCl2(p65-siRNA組)、Control-siRNA+200uMCoCl2乏氧組（Control-siRNA組）、Lip+200uM CoCl2乏氧組(Lip組)及YC-1+200uM CoCl2乏氧組（YC-1組）。首先，MTT法檢測各組A549細胞順鉑IC50; Annexin V-FI

8、TC/PI雙染流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染或加入YC-1單獨或聯(lián)合順鉑時A549細胞的凋亡率。然后，Western-blot檢測各組A549細胞中Bcl-2、p27的表達，MTT法繪制各組A549細胞生長曲線;流式細胞儀檢測各組A549細胞周期分布并與各組順鉑誘導(dǎo)A549細胞凋亡率行相關(guān)分析。第四部分:人肺腺癌A549細胞分為常氧對照組（control組）、200uM CoCl2乏氧組（CoCl2組）。培養(yǎng)24小時后，CoCl2組加入不同濃度EG

9、CG。MTT法測檢測EGCG單獨或聯(lián)合順鉑時對A549細胞的生長的影響;Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測EGCG對A549細胞凋亡率的影響; Hoechst染色法觀察A549細胞形態(tài);Western-blot檢測A549細胞中Bcl-2的表達。
　　結(jié)果：第一部分:細胞免疫組化及Western-blot檢測結(jié)果示CoCl2組A549細胞核內(nèi)HIF-1α表達較常氧對照組明顯增多;光鏡下CoCl2組A549細胞較常

10、氧對照組稀疏，電鏡下出現(xiàn)線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張及自噬泡形成等微觀結(jié)構(gòu)改變;常氧對照組A549細胞生長曲線呈S型，CoCl2組A549細胞生長曲線低平、增殖緩慢、G1期細胞增多、S期細胞減少;CoCl2組A549細胞凋亡率較常氧組無明顯增加，在相同濃度順鉑作用時其細胞的存活率及順鉑IC50均較常氧對照組增加，順鉑誘導(dǎo)細胞凋亡率較常氧對照組降低。第二部分:CoCl2組A549細胞中NF-κBp65mRNA轉(zhuǎn)錄及總蛋白中NF-κBp65表達較

11、常氧對照組無明顯增加，細胞核中NF-κBp65、HIF-1α蛋白表達及HIF-1αmRNA轉(zhuǎn)錄均較常氧組對照增加; p65-siRNA組A549細胞中NF-κBp65、HIF-1α在mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達均較CoCl2組明顯下降，YC-1組A549細胞中HIF-1α在蛋白表達較CoCl2組減少。第三部分:p65-siRNA組、YC-1組A549細胞在相同濃度順鉑作用時的存活率及順鉑IC50均較CoCl2組減少;單獨或與順鉑聯(lián)合作用時，凋

12、亡率均較CoCl2組明顯增加;Bcl-2、p27表達較CoCl2組降低;細胞增殖短暫加速，S期細胞比例上升，與順鉑誘導(dǎo)細胞凋亡呈正相關(guān)。第四部分:EGCG組A549細胞隨著EGCG干預(yù)濃度的增加生長明顯抑制，與順鉑聯(lián)合時對CoCl2化學(xué)乏氧條件下A549細胞生長抑制起協(xié)同作用;EGCG組A549細胞凋亡細胞較CoCl2組增加;Western-blot檢測結(jié)果示EGCG組A549細胞內(nèi)Bcl-2表達較CoCl2組減少。
　　結(jié)論 ：