Th17細(xì)胞在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用及復(fù)方甘草酸苷對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖和相關(guān)因子表達(dá)的研究.pdf

1、目的:通過(guò)銀屑病的動(dòng)物模型，檢測(cè)皮膚組織中Th17、IL-6、TNF-α和PGE2等細(xì)胞因子的含量，應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)皮膚組織中MMP-1和MMP-3的含量，觀察復(fù)方甘草酸苷對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖和相關(guān)因子表達(dá)的影響，以探討Th17細(xì)胞在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用及復(fù)方甘草酸苷治療銀屑病的機(jī)制，為復(fù)方甘草酸苷治療銀屑病提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支撐。
　　方法:1、體內(nèi)試驗(yàn):取新西蘭大白兔24只，隨機(jī)分為正常組、模型組、

2、治療組、對(duì)照組。采用根據(jù)HULTH的造模方法進(jìn)行家兔銀屑病模型的造模處理，在造模成功的1周之后按照設(shè)定好的實(shí)驗(yàn)方案對(duì)家兔給藥，通過(guò)連續(xù)性給藥6周之后，對(duì)家兔銀屑病的皮膚病理學(xué)形態(tài)及相關(guān)炎性細(xì)胞因子進(jìn)行檢查，以了解相關(guān)的變化情況。(1)對(duì)造模及用藥后的皮膚組織進(jìn)行收集，切片制作標(biāo)本，通過(guò)顯微鏡觀察其皮膚組織及細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化情況，對(duì)皮膚病理的結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。(2)通過(guò)皮膚組織的收集，觀察皮膚組織的外觀性狀。(3)采用ELISA法檢測(cè)皮膚組織

3、中Th17、IL-6、TNF-α和PGE2的含量。(4)運(yùn)用Western blot檢測(cè)皮膚組織中MMP-1和MMP-3的蛋白含量。
　　2、體外實(shí)驗(yàn):(1)復(fù)方甘草酸苷促進(jìn)HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究:取角朊細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型(HaCaT)進(jìn)行體外的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，通過(guò)體外3代的HaCaT細(xì)胞的培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)用，對(duì)HaCaT細(xì)胞進(jìn)行分組觀察，隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組(分別為含有復(fù)方甘草酸苷濃度為0ug/L、25ug/

4、L、50ug/L、100ug/L的10％FBS DMEM)。干預(yù)72h后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HaCaT細(xì)胞周期分布，分析G0/G1、S及G2/M期的細(xì)胞數(shù)量。并采用western-blot技術(shù)測(cè)定細(xì)胞中cyclinD1、CDK4、p21蛋白的表達(dá)。(2)復(fù)方甘草酸苷抑制HaCaT細(xì)胞調(diào)亡的實(shí)驗(yàn)研究:采用第3代HaCaT細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞并隨機(jī)分為高劑量、低劑量、中劑量和對(duì)照組及不加藥的模型組，其中正常的組織加含胎牛血清的10％的培養(yǎng)基進(jìn)行

5、培養(yǎng)，其余各組均加入含有1mmol/L的的10％FBS DMEM干預(yù)24h后加入，相應(yīng)濃度的藥物同樣也干預(yù)24h，通過(guò)電子顯微鏡對(duì)HaCaT細(xì)胞的組織形態(tài)及變化特點(diǎn)進(jìn)行收集，再通過(guò)流式細(xì)胞儀檢查HaCaT細(xì)胞的凋亡情況。蛋白的檢測(cè)采用Western-Blot的檢測(cè)方法，指標(biāo)包括Bcl-2、Bax、NF-κB。通過(guò)比色法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞的凋亡因子的表達(dá)，指標(biāo)有Caspase-3、Caspase-9。檢測(cè)皮膚組織中炎性因子表達(dá)的情況，指標(biāo)

6、包括Th17、IL-6、TNF-α和PGE2。
　　結(jié)果:1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:觀察家兔的皮膚組織切片，空白組在體實(shí)驗(yàn)可以看到其皮膚組織表面是光滑的，其組織細(xì)胞的排列整齊其分布均勻。而模型組的組織結(jié)構(gòu)受到一定的破壞，出現(xiàn)變薄的現(xiàn)象，細(xì)胞排列雜亂，個(gè)別地方可見(jiàn)組織表層消失的現(xiàn)象;而治療組和對(duì)照組皮膚組織損傷有所減輕，皮膚表面裂隙較少。ElISA檢測(cè)皮膚組織中Th17、IL-6、TNF-α和PGE2的含量，測(cè)定結(jié)果表明:與模型組比，治療組

7、皮膚組織中Th17、IL-6、TNF-α和PGE2表達(dá)量明顯降低(P＜0.05);與對(duì)照組相比，治療組的Th17、TNF-α和PGE2含量沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)，但I(xiàn)L-6略高于對(duì)照組(P＜0.05)。Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白組的皮膚中MMP-1、MMP-3蛋白含量較低。模型組皮膚中MMP-1、MMP-3蛋白含量顯著增高，治療組和對(duì)照組MMP-1、MMP-3蛋白含量顯著低于模型組，且兩組并無(wú)顯著性差異。

8、　　2、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　復(fù)方甘草酸苷促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖的研究:
　　形態(tài)結(jié)構(gòu)研究:可見(jiàn)藥物干預(yù)72h后各組細(xì)胞均呈現(xiàn)為正常的細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞形態(tài)主要為圓形、橢圓形及多角形，細(xì)胞核主要以圓形為主，并可見(jiàn)不規(guī)則的分葉狀，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，其中中、高劑量組均可見(jiàn)較多的細(xì)胞核分裂現(xiàn)象，其胞質(zhì)中富含粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。細(xì)胞周期分布:研究發(fā)現(xiàn)，中、高劑量組的G0/G1期與對(duì)照組相比顯著降低(P＜0.01)，而其G2/M期則明顯高于對(duì)照組

9、和低劑量組(P＜0.05)。
　　HaCaT細(xì)胞CyclinD1、 CDK4及p21蛋白的表達(dá):干預(yù)72h后，中、高劑量組的CyclinD1，CDK4蛋白的表達(dá)明顯高于其他兩組低劑量組及模型組的表達(dá)量(P＜0.05);同時(shí)低劑量組及對(duì)照組的P21的蛋白表達(dá)也要明顯高于中、高劑量組(P＜0.05)。
　　復(fù)方甘草酸苷抑制HaCaT細(xì)胞凋亡的研究:
　　HaCaT細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察:與對(duì)照組相比，通過(guò)造模之后的模型組出現(xiàn)了大

10、量的細(xì)胞壞死產(chǎn)生，HaCaT細(xì)胞出現(xiàn)了嚴(yán)重的凋亡現(xiàn)象，而高劑量及中劑量組通過(guò)治療藥物干預(yù)之后凋亡及壞死都較少發(fā)生。
　　HaCaT細(xì)胞Bax、Bcl-2、NF-κB蛋白的表達(dá):誘導(dǎo)凋亡后的HaCaT細(xì)胞經(jīng)藥物干預(yù)后，其HaCaT細(xì)胞的Bax蛋白表達(dá)，中劑量組、高劑量組明顯低于模型組，高劑量組明顯低于低劑量組;通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)HaCaT細(xì)胞表達(dá)Bcl-2，且有劑量的依賴性，高劑量和中劑量要高于低劑量和對(duì)照組，且NF-κB表達(dá)也有同樣的特

11、點(diǎn)，高劑量和中劑量要低于低劑量和對(duì)照組。
　　Western blot檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá):中劑量組、高劑量顯著低于模型組，高劑量組和中劑量組要低于低劑量組和對(duì)照組。蛋白活性同時(shí)顯示，凋亡蛋白的高劑量組和中劑量組要低于低劑量組和對(duì)照組。中劑量組、高劑量明顯低于低劑量組。
　　Th17、IL-6、TNF-α和PGE2的含量測(cè)定結(jié)果:與模型組比，高、中、低劑量組的Th17、IL-6、TNF-α和PG

12、E2表達(dá)量明顯降低(P＜0.05)，且隨著劑量的升高，Th17、IL-6、TNF-α和PGE2表達(dá)量明顯降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1、復(fù)方甘草酸苷能夠延緩銀屑病模型中皮膚組織的退變，抑制皮膚組織中相關(guān)炎癥因子Th17、IL-6、TNF-α和PGE2的表達(dá)，并可抑制MMPs的表達(dá)，其抑制作用存在一定的量效關(guān)系，抑制Th17及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)可能是復(fù)方甘草酸苷的治療機(jī)制。
　　2、復(fù)方甘草酸苷在體外能夠促進(jìn)HaCaT細(xì)