Th17和Treg細(xì)胞在肝硬化大鼠腸道細(xì)菌移位的作用研究.pdf

1、細(xì)菌移位(bacterial translocation，BT)是指細(xì)菌或者其產(chǎn)物從腸腔移位到腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph nodes，MLNs)或者其他的腸外器官。越來越多的證據(jù)表明，BT與肝硬化及其并發(fā)癥的發(fā)展密切相關(guān)，如肝性腦病，肝肺綜合征，肝腎綜合征和肝衰竭。事實上，BT相關(guān)感染和自發(fā)性腹膜炎是肝硬化患者死亡的主要原因。雖然在肝硬化患者中，主要是有感染的肝硬化患者中，已觀察到小腸細(xì)菌過度生長和腸道通透性增加與B

2、T有關(guān)，但是對與BT密切相關(guān)的腸道免疫變化的了解很少。幾種類型的腸道CD4+T細(xì)胞是防治BT的關(guān)鍵。Th17細(xì)胞主要存在于腸道固有層，尤其是小腸的固有層，是腸道粘膜免疫系統(tǒng)的重要組成部分，維持腸道粘膜免疫屏障的完整性密切相關(guān)，因此對于預(yù)防BT是非常關(guān)鍵的。Treg細(xì)胞在腸道固有層中聚集，維持腸道免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，因此影響B(tài)T的發(fā)生發(fā)展。因此，Th17和Treg細(xì)胞對維持腸道粘膜免疫系統(tǒng)的完整性起關(guān)鍵作用，與腸道細(xì)菌移位密切相關(guān)。本研究通過四

3、氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）和苯巴比妥制造肝硬化腹水大鼠模型，研究腸道固有層、肝臟和血液淋巴細(xì)胞中Treg(CD3+CD4+CD25+Foxp3+),Th17(CD3+CD4+ IL-17+)，和Th1(CD3+CD4+IFN-γ+)細(xì)胞的變化，分析他們與BT的關(guān)系和相互作用機制。
　　方法:
　　我們使用四氯化碳和苯巴比妥建立大鼠肝硬化腹水模型，使用臨床自動分析儀測定大鼠血清中的肝功能水平，

4、采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測腸道固有層、肝臟和血液淋巴細(xì)胞中Th17、Th1和Treg細(xì)胞比例，并運用酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)方法測定了血清中脂多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)的水平。
　　同時為了進(jìn)一步研究BT與肝硬化大鼠中Th17、Th1和Treg細(xì)胞變化之間的因果關(guān)系，我們?nèi)匀徊捎肅Cl4建立大鼠肝硬

5、化腹水模型，并使用諾氟沙星和萬古霉素對大鼠進(jìn)行腸道去污，分離大鼠外周血單核細(xì)胞、肝臟和腸道固有層淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測外周血單核細(xì)胞、肝臟和腸道固有層淋巴細(xì)胞中Th17、Th1和Treg細(xì)胞比例，并運用ELISA方法測定了血清中LBP的水平。
　　結(jié)果:
　　為了確定是否肝硬化影響了BT的發(fā)生，我們把分離到的MLNs進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常對照組沒有BT發(fā)生，CCl4誘導(dǎo)的肝硬化腹水大鼠BT的發(fā)生率是47.8％。與沒有

6、BT的肝硬化大鼠及正常大鼠相比，有BT的肝硬化大鼠血漿LBP的濃度更高，并且與MLNs分離培養(yǎng)到的菌落數(shù)成正相關(guān)(ρ=0.918，P＜0.001);與沒有BT的肝硬化大鼠相比，有BT的肝硬化大鼠具有更差的肝功能，更低的體重，更大的脾臟及更多的腹水量。并且，有BT的肝硬化大鼠血漿LBP的濃度與白蛋白濃度（ρ=-0.745;P＜0.01）及白蛋白/球蛋白成負(fù)相關(guān)（ρ=-0.769，P＜0.01），但是與AST(ρ=0.655，P＜0.05)

7、，TBil(ρ=0.688，P＜0.05)，和DBil(ρ=0.692，P＜0.05)成正相關(guān);與體重成負(fù)相關(guān)（ρ=-0.893，P＜0.001），與脾臟的重量成正相關(guān)(ρ=0.665，P＜0.05)，及腹水量也成正相關(guān)(ρ=0.878，P＜0.001)。有BT的肝硬化大鼠與沒有BT的肝硬化大鼠相比，近端小腸中Treg細(xì)胞百分比明顯增加(28.4±10.0 vs.13.2±2.9，P＜0.001)，Th17細(xì)胞及Th1細(xì)胞百分比均明顯減

8、少（14.9±2.8 vs.31.9±9.0，P＜0.001;9.7±3.2 vs.21.8±3.7，P＜0.001）;遠(yuǎn)端小腸中Treg細(xì)胞百分比也明顯增加（29.5±9.2 vs.15.3±3.1，P＜0.001），Th17細(xì)胞及Th1細(xì)胞百分比也均明顯減少(11.7±4.3 vs.24.1±6.2，P＜0.001;7.3±2.8 vs.19.7±4.7，P＜0.001);盲腸中只有Th17細(xì)胞百分比明顯減少(10.7±2.9 vs

9、.27.4±9.0，P＜0.001);結(jié)腸中Treg細(xì)胞百分比明顯增加（21.2±4.7 vs.14.5±1.9，P＜0.01），Th17細(xì)胞及Th1細(xì)胞百分比也均明顯減少（3.6±2.2 vs.8.3±2.8，P＜0.001;5.0±2.8 vs.18.1±6.1，P＜0.001）;肝臟中Treg細(xì)胞及Th17細(xì)胞百分比明顯增加（32.5±4.0 vs.19.2±4.0，P＜0.001;14.4±3.3 vs.9.4±0.8，P＜0.

10、01），Th1細(xì)胞百分比明顯減少（8.4±4.1 vs.13.3±3.0，P＜0.05）;外周血單核細(xì)胞中Th17細(xì)胞及Th1細(xì)胞百分比也均明顯減少（1.7±0.5vs.3.2±0.4，P＜0.01;2.0±0.2vs.4.0±0.6，P＜0.001）。并且，我們研究了在有BT的肝硬化大鼠血漿中LBP的濃度與這些細(xì)胞變化之間的關(guān)系，與Tregs細(xì)胞在近端小腸(ρ=0.691，P＜0.05)、遠(yuǎn)端小腸(ρ=0.636，P＜0.01)和肝臟

11、中的比例成正相關(guān)(ρ=0.760，P＜0.05);與Th17細(xì)胞在近端小腸(ρ=-0.836，P＜0.01)，遠(yuǎn)端小腸（ρ=-0.861，P＜0.01）及盲腸中(ρ=-0.675，P＜0.05)的比例成負(fù)相關(guān);與Th1細(xì)胞在近端小腸(ρ=-0.809，P＜0.01)，遠(yuǎn)端小腸(ρ=-0.802，P＜0.01)及肝臟中(ρ=-0.836，P＜0.05)的比例成負(fù)相關(guān)?？傊?，Th17、Th1和Treg細(xì)胞在近端小腸和遠(yuǎn)端小腸中的百分比均與血

12、漿中LBP的濃度具有明顯相關(guān)性，說明這些細(xì)胞在肝硬化大鼠近端小腸和遠(yuǎn)端小腸固有層中的免疫變化與BT密切相關(guān)。
　　為了進(jìn)一步研究BT與肝硬化大鼠中Th17、Th1和Treg細(xì)胞變化之間的因果關(guān)系，我們使用諾氟沙星和萬古霉素對大鼠進(jìn)行腸道去污。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用抗生素處理的肝硬化大鼠沒有BT發(fā)生。與使用安慰劑處理的肝硬化大鼠相比，使用抗生素處理的肝硬化大鼠血清中LBP的濃度更低，血清中ALT, AST, TBil和DBil水平更低，大鼠

13、的終體重更重，脾臟及腹水的量更小，Tregs細(xì)胞在近端小腸中的比例更低，Th17細(xì)胞在整個小腸、盲腸、結(jié)腸、肝臟和血液中的比例更高。而且這些細(xì)胞在使用抗生素處理的肝硬化大鼠組比例的變化與正常大鼠用及沒用抗生素相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步說明了BT引起了這些細(xì)胞在肝硬化中的變化。
　　結(jié)論:
　　總之，BT可能增加了肝硬化大鼠近端小腸中的Tregs細(xì)胞，減少了肝硬化大鼠整個腸道固有層和血液中的Th17細(xì)胞;CCl4誘導(dǎo)的肝硬化大

14、鼠增加了Tregs細(xì)胞在肝臟中的百分比，減少了Th1細(xì)胞在盲腸和血液中的百分比;BT可能加劇了肝硬化大鼠整個小腸固有層和肝臟中Th1細(xì)胞的減少，Th17細(xì)胞在肝臟中的增加，及Tregs細(xì)胞在遠(yuǎn)端小腸和結(jié)腸中的升高。我們的數(shù)據(jù)暗示了肝硬化大鼠腸道固有層中Th17細(xì)胞的減少和Treg細(xì)胞的增加有助于BT的發(fā)生發(fā)展。免疫學(xué)的變化是器官特異性的，并且與BT相關(guān)。肝硬化導(dǎo)致了BT，BT可能反過來加重的肝硬化的發(fā)展肝硬化和BT之間形成一個惡性循環(huán)。