白念珠菌多藥耐藥蛋白Cdr1p構效關系研究.pdf

1、Cdr1p構效關系的研究有助于深入了解白念珠菌耐藥性產生的分子機制。采用定點突變方法獲得TMS1(I514L)、TMS2(L563F)、TMS4(W629L和M631I)、TMS6(A772I和L776F)、TMS8(F1239L和M1246Y)和TMS10(A1324L)變異，在釀酒酵母AD1-8u-菌株中表達，測定表達變異蛋白菌株藥物敏感性的改變，羅丹明6G外轉運功能的改變，及在氮唑類藥物與羅丹明6G共同作用下外轉運功能的變化。結果

2、發(fā)現(xiàn)L776F、M1246Y和A1324L變異引起菌株對氮唑類藥物敏感性明顯增加；I514L、L563F、L776F、F1239L、M1246Y和A1324L變異引起菌株外轉運羅丹明6G能力的下降；表達野生型蛋白菌株中氟康唑、酮康唑、伊曲康唑和咪康唑與羅丹明6G共同作用時抑制羅丹明6G的外轉運，而表達變異蛋白菌株中氮唑類藥物與羅丹明6G共同作用下羅丹明6G的外轉運能力各異。本研究首次初步證明TMS4、TMS8和TMS10也是Cdr1p重

3、要的底物結合轉運位點，發(fā)現(xiàn)了與底物結合轉運相關的關鍵性氨基酸殘基。 Cdr1p的高表達是白念珠菌產生耐藥性的重要機制，對Cdr1p構效關系的研究有助于了解其底物結合轉運的分子機制，為設計合理的Cdr1p抑制劑從而克服白念珠菌耐藥奠定理論基礎。本課題首先將Cdr1p～Cdr4p四種ABC轉運蛋白的跨膜區(qū)氨基酸序列進行比對，然后將Cdr1p跨膜區(qū)1、2、4、6、8、10的I514、L563、W629、M631、A772、L776、F1

4、239、M1246和A1324氨基酸殘基突變?yōu)镃dr3p相應位置上的514L、563F、629L、772I、776F、1239L、1246Y和1324L，構建野生型及突變型蛋白的表達載體。將其在敲除已知轉運蛋白基因的釀酒酵母菌株AD1-8u-中表達。藥物敏感性實驗檢測各菌株對藥物敏感性的改變，羅丹明6G外排實驗測定Cdr1p轉運能力的變化，氮唑類藥物與羅丹明6G共同作用時位點變異對外轉運的影響。 藥物敏感性實驗結果顯示，表達變異

5、蛋白的菌株對氟康唑敏感性增加，而L776F、M1246Y和A1324L變異菌株對酮康唑敏感性增加；I514L、L563F、L776F、M1246Y和A1324L變異菌株對咪康唑敏感性增加；L776F、M1246Y和A1324L變異菌株對伊曲康唑敏感性增加。同時I514L、M631I和A772I變異菌株還對制霉菌素敏感性提高；而A772I、L776F和M1246Y變異菌株對茴香霉素敏感性增加；L776F、F1239L和M1246Y變異菌株

6、對特比萘酚敏感性增加，L776和A1324變異菌株對維拉帕米敏感性增加，M1246Y變異菌株對三氟拉嗪、他莫昔芬和麥角甾醇敏感性增加。 羅丹明6G外轉運實驗發(fā)現(xiàn)I514L、L563F、L776F、F1239、M1246Y和A1324L變異引起羅丹明6G的外轉運減少，提示這些位點可能與羅丹明6G的結合轉運相關。氮唑類藥物氟康唑、酮康唑、伊曲康唑和咪康唑與羅丹明6G的共同作用下羅丹明6G的外轉運實驗發(fā)現(xiàn)表達野生型蛋白的菌株中四種氮唑

7、類藥物引起羅丹明6G外轉運能力的降低，說明氮唑類藥物和羅丹明6G可能存在共同的結合轉運位點。變異菌株中四種氮唑類藥物與羅丹明6G的共同作用下羅丹明6G外轉運能力的變化情況不一致，L563F和M1246Y變異菌株中四種氮唑類藥物抑制羅丹明6G的外轉運，氟康唑在I514L和A1324L菌株中不能引起細胞外R6G濃度降低，I514L、M631I、A772I和F1239L菌株中酮康唑不引起R6G外轉運的減少，咪康唑在I514L、W629L、M6

8、31I、A772I、L776F和F1239L中不引起細胞外R6G濃度的下降，而伊曲康唑在I514L、W629L和M631I不引起R6G外轉運能力的下降。 本研究發(fā)現(xiàn)位點變異對氮唑類藥物和R6G的外轉運都有影響，不同變異的影響程度不同，而某一位點變異對氮唑類藥物和R6G的外轉運影響程度也不同。首次證實Cdr1p跨膜區(qū)4、8、10也是重要的底物結合轉運位點，跨膜區(qū)1和2也與氮唑類藥物的結合轉運有關，而且進一步證明跨膜區(qū)6在底物結合轉

9、運中發(fā)揮重要作用。I514(TMS1)位點可能與氮唑類藥物的結合轉運有關，W629和M631(TMS4)位點與咪康唑、伊曲康唑的特異性結合有關，L776(TMS6)位點與氮唑類藥物、維拉帕米和R6G的結合轉運有關，F(xiàn)1239(TMS8)位點可能與酮康唑、咪康唑的結合轉運更相關，M1246(TMS8)位點與眾多結構各異的底物：氮唑類藥物、羅丹明6G、特比萘芬、麥角甾醇結合轉運有關，位點A1324(TMS10)與氮唑類藥物和R6G的外轉運相