MicroRNAs在肝癌細(xì)胞復(fù)發(fā)、EMT轉(zhuǎn)換及干細(xì)胞特性維持中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　肝癌是目前發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤之一，根據(jù)1999年上海市腫瘤流行病學(xué)調(diào)查，肝癌的發(fā)病率在男性40.0/10萬，在女性為14.8/10萬，分別列惡性腫瘤發(fā)病率第3位和第5位。據(jù)1998年統(tǒng)計,全球肝癌死亡率為10.3/10萬,在全球男性中占第7位,女性中占第9位。在我國，根據(jù)1997年報道27個省、市、自治區(qū)1990-1992年抽樣地區(qū)分析，肝癌死亡率為20.37/10萬（男性29.01/10萬，女性11.21/

2、10萬），占惡性腫瘤死亡率的第2位，在男性中僅次于胃癌，在女性則次于胃癌和食管癌居第3位。
　　原發(fā)性肝癌起病隱匿，在早期（亞臨床肝癌）并無明顯的癥狀和體征，若具有典型的癥狀和體征，則已為中晚期，治療效果較差。晚期肝癌的治療仍以放、化療為基礎(chǔ)的綜合治療為主，在肝癌的治療中，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和超級耐藥始終是非常棘手的問題。肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多環(huán)節(jié)的過程，其分子機(jī)制涉及癌基因、抑癌基因、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因、生長因子及其受體、細(xì)胞外基質(zhì)、腫瘤

3、血管、機(jī)體免疫等多個環(huán)節(jié)。近年來，人們在乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、食道癌模型中發(fā)現(xiàn)了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）現(xiàn)象，說明EMT也是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，并與腫瘤干細(xì)胞形成和耐藥性相關(guān)。在原發(fā)性肝癌的細(xì)胞及動物模型、臨床研究中同樣發(fā)現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，且EMT的發(fā)生與肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和化療耐藥相關(guān)。
　　Epithelial-to-mesenchymal transition(EMT)是一個上皮細(xì)胞失去上皮特性同時獲得間質(zhì)特性，并且具有

4、運動能力的生物學(xué)過程，目前認(rèn)為EMT與腫瘤轉(zhuǎn)移初始階段有關(guān)。Gregory等的研究提示 microRNA-200的家族成員（microRNA-200a/b/c，microRNA-141和microRNA-492）及microRNA-205的表達(dá)水平在TGF-β誘導(dǎo)的EMT過程中顯著降低，提示microRNA可能調(diào)控EMT現(xiàn)象。后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，microRNA-200家族及microRNA-205可以起始EMT轉(zhuǎn)換過程，提示microRN

5、A在EMT的調(diào)控中起重要作用。而最新的研究表明EMT轉(zhuǎn)換同樣可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療或靶向藥物的耐藥，Ceppi等研究就發(fā)現(xiàn)對西妥昔單抗和順鉑耐藥的肺癌細(xì)胞中，間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的蛋白表達(dá)量顯著增高，EMT現(xiàn)象特征十分明顯，而microRNA-200c的過表達(dá)則可以部分恢復(fù)細(xì)胞對順鉑的敏感并減低其侵襲能力。
　　微小RNA(microRNA，miRNA)為一類高度保守的、長度通常為20-24個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，近年來的研究表明，

6、microRNA和肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究基于60例臨床肝癌組織標(biāo)本（30例復(fù)發(fā)，30例原發(fā)樣本）的microRNA表達(dá)譜分析，探究與EMT，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的microRNAs功能，特別是miRNA-489在肝癌的EMT轉(zhuǎn)換和復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及miRNA-205在肝癌干細(xì)胞特性的維持作用，進(jìn)一步確定其關(guān)鍵功能靶標(biāo)和下游信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，深入了解 HCC的EMT轉(zhuǎn)換和干細(xì)胞形成和維持的分子機(jī)制，為肝癌提供新的預(yù)后標(biāo)志物和基于miRNA的

7、肝癌治療策略具有至關(guān)重要的臨床意義。
　　第一部分微小RNA(microRNA)在肝癌復(fù)發(fā)和細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）中的作用
　　[目的]本部分研究旨在進(jìn)一步采用microRNA表達(dá)譜分析和實時定量熒光PCR分析復(fù)發(fā)與非復(fù)發(fā)的肝癌臨床組織及相關(guān)細(xì)胞株，挑選和鑒定可能與原發(fā)性肝癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移相關(guān)microRNAs。
　　[方法]
　　1．收集臨床上復(fù)發(fā)和非復(fù)發(fā)的肝癌組織樣本，結(jié)合一系列肝癌細(xì)胞系，利用microR

8、NA表達(dá)譜芯片技術(shù)（GeneChip microRNA2.0 Array，affymetrix），檢測相關(guān)樣品的microRNAs表達(dá)圖譜，并比較其差異。
　　2．為了進(jìn)一步驗證芯片結(jié)果的可靠性，利用miR-qRT-PCR定量 PCR試劑盒（Applied Biosystem），以U6作為內(nèi)參，對差異表達(dá)的microRNA進(jìn)行實時定量 PCR驗證。
　　3．miRNA-489在肝癌復(fù)發(fā)組織中差異性很高，我們推測miRNA-4

9、89可能參與肝癌的復(fù)發(fā)；使用生物信息軟件，我們尋找 miRNA-489在基因組中的定位及靶點。
　　4. miRNA-205因表達(dá)差異及在干細(xì)胞特性維持中的作用，是我們重點研究的miRNA之一，使用生物信息軟件，我們尋找miRNA-205在基因組中的定位及靶點。
　　[結(jié)果]
　　1.Agilent human miRNA芯片V12.0證實和親本肝癌細(xì)胞相比，復(fù)發(fā)的肝癌細(xì)胞有30個表達(dá)差異的miRNA，其中miRNA-

10、489在復(fù)發(fā)肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，是原來肝癌細(xì)胞組織的12倍。
　　2. RT-PCR驗證miRNA的表達(dá)，miRNA-489、miRNA-34a、miRNA-21和miRNA-7在復(fù)發(fā)肝癌細(xì)胞組織中高表達(dá)，上調(diào)12.3、5.2、3.1、2.2倍,而miRNA-205、miRNA-145、miRNA-452、miRNA-125a-3p等在復(fù)發(fā)細(xì)胞中低表達(dá)，分別下調(diào)16、14、7.1、6.5倍，結(jié)果和芯片結(jié)果一致，驗證了芯片結(jié)果。

11、>　　[結(jié)論]本研究證實miR-489及miR-205可能參與肝癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能涉及EMT轉(zhuǎn)換及干細(xì)胞特性的維持。
　　第二部分 miRNA-489在肝癌細(xì)胞復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及EMT轉(zhuǎn)換中的可能機(jī)制
　　[目的]本部分旨在闡明miRNA-489參與肝癌細(xì)胞復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及EMT轉(zhuǎn)換中的可能機(jī)制。
　　[方法]
　　1．miRNA-489在復(fù)發(fā)肝癌細(xì)胞株中高表達(dá)（為親本肝癌細(xì)胞株的12倍左右），我們推測miRNA-4

12、89可能參與肝癌細(xì)胞復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移；使用生物信息軟件，結(jié)合microRNA數(shù)據(jù)庫Miranda(www.microrna.org/microma/home.do)，miRBASE(www.mirbase.org)和TargetScan(http://www.targetscan.org/)及PicTar(http://pictar.bio.nyu.edu)等，我們尋找miRNA-489潛在的靶點。
　　2．microRNA通過和靶基因

13、的3’UTR段相結(jié)合而發(fā)揮調(diào)控作用，我們構(gòu)建了Smad33’UTR段的wild-type和mutant的載體。
　　3．使用dual-luciferase熒光報告系統(tǒng)，以證明在細(xì)胞內(nèi)miRNA-489是否可以和Smad3結(jié)合。
　　4．轉(zhuǎn)染 miRNA-489表達(dá)質(zhì)粒，在低表達(dá) miRNA-489的肝癌細(xì)胞株中高表達(dá)miRNA-489后，檢測相關(guān)細(xì)胞通路的蛋白的表達(dá)及EMT轉(zhuǎn)換。
　　[結(jié)果]
　　1.結(jié)合生物信

14、息軟件，我們證實了Smad3是miRNA-489下游作用靶點之一。
　　2.成功構(gòu)建了Smad33’UTR段的wild-type和mutant的載體。
　　3.發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)后，Smad33’UTR突變的（mutant）的質(zhì)粒因與miRNA-489不能結(jié)合，其熒光強(qiáng)度高，而Smad33’UTR野生型的（wild-type）的質(zhì)粒因為能與miRNA-489結(jié)合，導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制受阻，其熒光強(qiáng)度減低了約60％，其熒光強(qiáng)度

15、值之比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　4.在上皮型的肝癌細(xì)胞中，miRNA-489低表達(dá)，而高表達(dá)miRNA-489后，細(xì)胞向間質(zhì)型轉(zhuǎn)換。
　　5.在間質(zhì)型肝癌細(xì)胞中，miRNA-489高表達(dá)，而低表達(dá)miRNA-489后，細(xì)胞向上皮型轉(zhuǎn)換。
　　[結(jié)論]本研究證實在體外，miRNA-489通過調(diào)節(jié)Smad3通路，參與調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)換，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
　　第三部分 miRNA-205在

16、肝癌細(xì)胞干細(xì)胞特性維持中的作用和可能機(jī)制
　　[目的]本部分旨在闡明miRNA-205在維持肝癌干細(xì)胞特性中的作用及可能機(jī)制。
　　[方法]
　　1．miRNA-205可能參與肝癌干細(xì)胞特性的維持；使用生物信息軟件，結(jié)合microRNA數(shù)據(jù)庫Miranda(www.microrna.org/microma/home.do)，miRBASE(www.mirbase.org)和TargetScan(http://www.t

17、argetscan.org/)及PicTar(http://pictar.bio.nyu.edu)等，我們尋找miRNA-205潛在的靶點。
　　2．microRNA通過和靶基因的3’UTR段相結(jié)合而發(fā)揮調(diào)控作用，我們構(gòu)建了PLCβ-13’UTR段的wild-type和mutant的載體。
　　3．使用dual-luciferase熒光報告系統(tǒng)，以證明在細(xì)胞內(nèi)miRNA-205是否可以和PLCβ-1結(jié)合。
　　4．mi

18、RNA-205結(jié)合PLCβ-1可以上調(diào)CD24+維持肝癌干細(xì)胞特性。
　　[結(jié)果]1.結(jié)合生物信息軟件，我們證實了 PLCβ-1是 miR-205下游作用靶點之一。
　　2.成功構(gòu)建了PLCβ-13’UTR段的wild-type和mutant的載體。
　　3.發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)后，PLCβ-13’UTR突變的（mutant）的質(zhì)粒因與microRNA-205不能結(jié)合，其熒光強(qiáng)度高，而PLCβ-13’UTR野生型（wi