陽離子膠原水凝膠涂層血管內(nèi)覆膜支架實現(xiàn)兔主動脈局部基因轉(zhuǎn)染的實驗研究.pdf

1、陽離子膠原水凝膠涂層血管內(nèi)覆膜支架實現(xiàn)兔主動脈局部基因轉(zhuǎn)染的實驗研究主動脈瘤(Aortic aneurysm)是一種危害性極大，死亡率甚高的全球性常見病。隨著社會老齡化的到來，這類疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。因此，如何改進治療方法和技術、降低死亡率已成為國內(nèi)外學者共同面臨的一個亟待解決的、也是比較棘手的研究課題。1952年Dubost等首先對腹主動脈瘤進行了傳統(tǒng)外科手術修補術，但死亡率很高，尤其是動脈瘤破裂的急診手術死亡率達50％-60

2、％。而且尚有大批患者因合并其他重要器官的功能障礙而難以實施手術治療。1991年，Parodi等首次提出血管內(nèi)主動脈覆膜支架置人術(Endoluminal AorticStent Graft P1acement)，即主動脈瘤腔內(nèi)修復術(Endoluminal Aortic An—eurysm Repair，EAAR)。由于它與傳統(tǒng)外科手術相比，具有不開胸、不開腹，創(chuàng)傷小，手術并發(fā)癥少，住院時間短和適應證廣泛等優(yōu)點，目前已成為這類疾病，尤其

3、是高危病人臨床治療的首選方法。盡管EAAR具有上述諸多優(yōu)勢，全身并發(fā)癥發(fā)生率也較低，但靶血管局部的并發(fā)癥卻依然較高。其中最棘手的主要是術后的持續(xù)性內(nèi)漏所導致的瘤體持續(xù)增大甚至破裂，以及中遠期出現(xiàn)的內(nèi)支架移位及人工血管覆膜材料破損等。國外學者通過對臨床病例的再次開腹手術活檢及尸檢結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，盡管覆膜血管支架能夠達到對病變主動脈局部的機械性修復目的，但由于靶血管局部不能及時地自我再生和修復，與覆膜血管支架之間幾乎沒有組織學上的愈合，從而造

4、成了內(nèi)支架與主動脈壁之間附著不牢固和內(nèi)漏持續(xù)存在等問題。因此，如何促進主動脈壁自我增生和局部修復，使覆膜血管支架與主動脈壁盡快產(chǎn)生良好的愈合及修復，已成為亟待解決的關鍵問題和國內(nèi)外研究的熱點。 通過臨床主動脈瘤壁標本的形態(tài)學及組織學分析發(fā)現(xiàn)，其特征性表現(xiàn)包括慢性炎性細胞浸潤、細胞外基質(zhì)降解和平滑肌細胞調(diào)亡等。細胞外基質(zhì)是維持主動脈壁強度和彈性的重要因素，而平滑肌細胞又是一些基質(zhì)分子，如彈力蛋白和膠原蛋白的主要來源，可以維持主動脈

5、中層的完整性，促進主動脈壁與覆膜支架的愈合。因此，如果能通過基因轉(zhuǎn)染與治療的手段，實現(xiàn)主動脈局部目的治療基因的穩(wěn)定、高效的基因轉(zhuǎn)染與持續(xù)基因表達，則有望從根本上解決病變主動脈局部的修復愈合問題。 目前血管系統(tǒng)基因治療面臨很多問題，包括基因轉(zhuǎn)染率低，轉(zhuǎn)染基因在靶血管內(nèi)存留時間短，承載轉(zhuǎn)染基因的生物可降解材料和涂層引起的局部炎性反應，全身系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)染和經(jīng)皮輸送過程的血管外膜轉(zhuǎn)染等。因此提高靶器官及系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)染率，實現(xiàn)轉(zhuǎn)染基因的緩慢

6、可控釋放，選擇生物相容性好的可降解材料，降低或杜絕全身系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)染，實現(xiàn)目的基因的靶向穩(wěn)定地表達是血管內(nèi)基因治療研究的關鍵問題。本實驗選用質(zhì)粒(Plas-mid)作為載體，但這種載體存在轉(zhuǎn)染率低的問題，因此，可應用生物可降解材料來承載質(zhì)粒DNlA片段，并通過可降解材料的緩慢降解來實現(xiàn)所承載的目的基因的緩釋以延長其在血管局部存留時問，從而提高基因轉(zhuǎn)染率。 近年來，Tabata等開展了應用生物可降解的陽離子膠原水凝膠(Cationi

7、zedgelatin hydrogels，CGH)承載質(zhì)粒DNA韻研究，取得了滿意的結(jié)果，但該研究尚僅限于將CGH與質(zhì)粒DNA復合物注射于動物的皮下及肌肉內(nèi)。而本研究旨在將CGH均勻涂覆于表面改性后的血管覆膜支架的覆膜織物表面。 本研究擬以生物可降解材料CGH涂層的覆膜血管支架作為基本平臺，以pCAGGS質(zhì)粒為基因轉(zhuǎn)染載體，來實現(xiàn)兔主動脈局部的報告基因LacZcDNA高效、靶向轉(zhuǎn)染與表達，以便為未來進一步選擇目的治療基因?qū)崿F(xiàn)主動

8、脈局部基因轉(zhuǎn)染并促進主動脈瘤愈合提供實驗基礎。 實驗一 體外培養(yǎng)大鼠主動脈平滑肌細胞 pCAGGS-LacZ基因轉(zhuǎn)染的實驗研究 實驗結(jié)果 1．pCAGGS—LacZ及pCAGGS濃度在4～5mg/ml之間，ABS值260/280均為1.6—1.8，說明DNA純度良好； 2．雙酶切反應后電泳結(jié)果證實提純的質(zhì)粒DNA基因序列與基因序列庫中pCAGGS-LacZ的序列相吻合； 3．X—gal染色證實培

9、養(yǎng)的RASMC細胞pCAGGS-LaeZ轉(zhuǎn)染成功，并有β-半乳糖苷酶表達，細胞質(zhì)內(nèi)有深藍染色，基因轉(zhuǎn)染率約為30％； 4．Western-blotting蛋白免疫印記法檢測到LacZ基因表達產(chǎn)物β-半乳糖苷酶。 實驗二 陽離子膠原水凝膠涂層承載pCAGGS-LacZ 的血管內(nèi)覆膜支架實驗研究 實驗結(jié)果 1．平均每個管狀聚酯纖維織物(7mm×10mm)涂覆CGH的含量為O．0034g。 2．將

10、該覆膜支架浸于Na<'125>I標記的200μl pCAGGS—LacZ(4mg/m1)溶液中，平均每個支架的CGH涂層吸收pCAGGS—LacZ溶液比率為81．8％；支架緝裝與釋放后存留的pcAGGs—LacZ百分比高達94.2％；支架實際能夠承載pCAGGS—LacZ的百分比為77.1％，即平均每個支架承載pCAGGS--LaeZ約617μg。 3．CGH涂層支架在兔體內(nèi)降解釋放模式：支架置人初期pCAGGS--LacZ爆發(fā)

11、釋放(約60％)；其后緩慢平穩(wěn)降解，至第七天時降解釋放完全。 實驗三陽離子膠原水凝膠涂層承載pCAGGS—LacZ 血管內(nèi)覆膜支架兔活體內(nèi)主動脈壁基因轉(zhuǎn)染的實驗研究 實驗結(jié)果 1．X線透視下置人覆膜支架后造影顯示支架位置良好，主動脈內(nèi)血流通暢，各主要血管分支顯示清晰。 2．動物處死后尸檢見支架位置良好，無移位及明顯血栓形成。 3．X-gal染色：承載pCAGGS-LacZ覆膜支架處主動脈壁染色

12、后可見散在深藍色點狀著色，證明具有β一半乳糖苷酶活性，承載pCAGGS的對照覆膜支架處主動脈壁未見深藍色點狀著色。 4．X-gal染色后的標本進行HE染色，見主動脈內(nèi)皮細胞層損傷，只有少量內(nèi)皮細胞殘存，大部分內(nèi)彈力板連續(xù)完整，個別處破損，中層平滑肌細胞排列整齊；無明顯炎癥細胞浸潤及平滑肌細胞增殖，部分內(nèi)皮細胞胞質(zhì)內(nèi)可見深藍染色，另外個別內(nèi)彈力板受損處可見平滑肌細胞胞質(zhì)內(nèi)深藍染色。 5．Rt-PCR檢測結(jié)果證實置人承載pC

13、AGGS-LacZ覆膜支架處主動脈壁組織內(nèi)含有編碼β-半乳糖苷酶的mRNA。 6．覆膜支架置入處遠端主動脈、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟Rt-PCR結(jié)果均為陰性，證實無全身系統(tǒng)播散性基因轉(zhuǎn)染。 pCAGGS質(zhì)粒是理想的非病毒性基因轉(zhuǎn)染載體，LacZ可作為基因轉(zhuǎn)染的報告基因，其表達產(chǎn)物的檢測方便易行。CGH涂覆聚酯纖維的血管內(nèi)覆膜支架是很有前途的基因轉(zhuǎn)染承載平臺，涂層材料與質(zhì)粒DNA通過電荷吸引形成穩(wěn)定復合物，在支架組裝與輸送過