陽(yáng)離子膠原水凝膠涂層血管內(nèi)覆膜支架實(shí)現(xiàn)兔主動(dòng)脈局部基因轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、陽(yáng)離子膠原水凝膠涂層血管內(nèi)覆膜支架實(shí)現(xiàn)兔主動(dòng)脈局部基因轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)研究主動(dòng)脈瘤(Aortic aneurysm)是一種危害性極大，死亡率甚高的全球性常見病。隨著社會(huì)老齡化的到來(lái)，這類疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。因此，如何改進(jìn)治療方法和技術(shù)、降低死亡率已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者共同面臨的一個(gè)亟待解決的、也是比較棘手的研究課題。1952年Dubost等首先對(duì)腹主動(dòng)脈瘤進(jìn)行了傳統(tǒng)外科手術(shù)修補(bǔ)術(shù)，但死亡率很高，尤其是動(dòng)脈瘤破裂的急診手術(shù)死亡率達(dá)50％-60

2、％。而且尚有大批患者因合并其他重要器官的功能障礙而難以實(shí)施手術(shù)治療。1991年，Parodi等首次提出血管內(nèi)主動(dòng)脈覆膜支架置人術(shù)(Endoluminal AorticStent Graft P1acement)，即主動(dòng)脈瘤腔內(nèi)修復(fù)術(shù)(Endoluminal Aortic An—eurysm Repair，EAAR)。由于它與傳統(tǒng)外科手術(shù)相比，具有不開胸、不開腹，創(chuàng)傷小，手術(shù)并發(fā)癥少，住院時(shí)間短和適應(yīng)證廣泛等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為這類疾病，尤其

3、是高危病人臨床治療的首選方法。盡管EAAR具有上述諸多優(yōu)勢(shì)，全身并發(fā)癥發(fā)生率也較低，但靶血管局部的并發(fā)癥卻依然較高。其中最棘手的主要是術(shù)后的持續(xù)性內(nèi)漏所導(dǎo)致的瘤體持續(xù)增大甚至破裂，以及中遠(yuǎn)期出現(xiàn)的內(nèi)支架移位及人工血管覆膜材料破損等。國(guó)外學(xué)者通過對(duì)臨床病例的再次開腹手術(shù)活檢及尸檢結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，盡管覆膜血管支架能夠達(dá)到對(duì)病變主動(dòng)脈局部的機(jī)械性修復(fù)目的，但由于靶血管局部不能及時(shí)地自我再生和修復(fù)，與覆膜血管支架之間幾乎沒有組織學(xué)上的愈合，從而造

4、成了內(nèi)支架與主動(dòng)脈壁之間附著不牢固和內(nèi)漏持續(xù)存在等問題。因此，如何促進(jìn)主動(dòng)脈壁自我增生和局部修復(fù)，使覆膜血管支架與主動(dòng)脈壁盡快產(chǎn)生良好的愈合及修復(fù)，已成為亟待解決的關(guān)鍵問題和國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。 通過臨床主動(dòng)脈瘤壁標(biāo)本的形態(tài)學(xué)及組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其特征性表現(xiàn)包括慢性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞外基質(zhì)降解和平滑肌細(xì)胞調(diào)亡等。細(xì)胞外基質(zhì)是維持主動(dòng)脈壁強(qiáng)度和彈性的重要因素，而平滑肌細(xì)胞又是一些基質(zhì)分子，如彈力蛋白和膠原蛋白的主要來(lái)源，可以維持主動(dòng)脈

5、中層的完整性，促進(jìn)主動(dòng)脈壁與覆膜支架的愈合。因此，如果能通過基因轉(zhuǎn)染與治療的手段，實(shí)現(xiàn)主動(dòng)脈局部目的治療基因的穩(wěn)定、高效的基因轉(zhuǎn)染與持續(xù)基因表達(dá)，則有望從根本上解決病變主動(dòng)脈局部的修復(fù)愈合問題。 目前血管系統(tǒng)基因治療面臨很多問題，包括基因轉(zhuǎn)染率低，轉(zhuǎn)染基因在靶血管內(nèi)存留時(shí)間短，承載轉(zhuǎn)染基因的生物可降解材料和涂層引起的局部炎性反應(yīng)，全身系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)染和經(jīng)皮輸送過程的血管外膜轉(zhuǎn)染等。因此提高靶器官及系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)染率，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染基因的緩慢

6、可控釋放，選擇生物相容性好的可降解材料，降低或杜絕全身系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)染，實(shí)現(xiàn)目的基因的靶向穩(wěn)定地表達(dá)是血管內(nèi)基因治療研究的關(guān)鍵問題。本實(shí)驗(yàn)選用質(zhì)粒(Plas-mid)作為載體，但這種載體存在轉(zhuǎn)染率低的問題，因此，可應(yīng)用生物可降解材料來(lái)承載質(zhì)粒DNlA片段，并通過可降解材料的緩慢降解來(lái)實(shí)現(xiàn)所承載的目的基因的緩釋以延長(zhǎng)其在血管局部存留時(shí)問，從而提高基因轉(zhuǎn)染率。 近年來(lái)，Tabata等開展了應(yīng)用生物可降解的陽(yáng)離子膠原水凝膠(Cationi

7、zedgelatin hydrogels，CGH)承載質(zhì)粒DNA韻研究，取得了滿意的結(jié)果，但該研究尚僅限于將CGH與質(zhì)粒DNA復(fù)合物注射于動(dòng)物的皮下及肌肉內(nèi)。而本研究旨在將CGH均勻涂覆于表面改性后的血管覆膜支架的覆膜織物表面。 本研究擬以生物可降解材料CGH涂層的覆膜血管支架作為基本平臺(tái)，以pCAGGS質(zhì)粒為基因轉(zhuǎn)染載體，來(lái)實(shí)現(xiàn)兔主動(dòng)脈局部的報(bào)告基因LacZcDNA高效、靶向轉(zhuǎn)染與表達(dá)，以便為未來(lái)進(jìn)一步選擇目的治療基因?qū)崿F(xiàn)主動(dòng)

8、脈局部基因轉(zhuǎn)染并促進(jìn)主動(dòng)脈瘤愈合提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)一 體外培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞 pCAGGS-LacZ基因轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)研究 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1．pCAGGS—LacZ及pCAGGS濃度在4～5mg/ml之間，ABS值260/280均為1.6—1.8，說明DNA純度良好； 2．雙酶切反應(yīng)后電泳結(jié)果證實(shí)提純的質(zhì)粒DNA基因序列與基因序列庫(kù)中pCAGGS-LacZ的序列相吻合； 3．X—gal染色證實(shí)培

9、養(yǎng)的RASMC細(xì)胞pCAGGS-LaeZ轉(zhuǎn)染成功，并有β-半乳糖苷酶表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有深藍(lán)染色，基因轉(zhuǎn)染率約為30％； 4．Western-blotting蛋白免疫印記法檢測(cè)到LacZ基因表達(dá)產(chǎn)物β-半乳糖苷酶。 實(shí)驗(yàn)二 陽(yáng)離子膠原水凝膠涂層承載pCAGGS-LacZ 的血管內(nèi)覆膜支架實(shí)驗(yàn)研究 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1．平均每個(gè)管狀聚酯纖維織物(7mm×10mm)涂覆CGH的含量為O．0034g。 2．將

10、該覆膜支架浸于Na<'125>I標(biāo)記的200μl pCAGGS—LacZ(4mg/m1)溶液中，平均每個(gè)支架的CGH涂層吸收pCAGGS—LacZ溶液比率為81．8％；支架緝裝與釋放后存留的pcAGGs—LacZ百分比高達(dá)94.2％；支架實(shí)際能夠承載pCAGGS—LacZ的百分比為77.1％，即平均每個(gè)支架承載pCAGGS--LaeZ約617μg。 3．CGH涂層支架在兔體內(nèi)降解釋放模式：支架置人初期pCAGGS--LacZ爆發(fā)

11、釋放(約60％)；其后緩慢平穩(wěn)降解，至第七天時(shí)降解釋放完全。 實(shí)驗(yàn)三陽(yáng)離子膠原水凝膠涂層承載pCAGGS—LacZ 血管內(nèi)覆膜支架兔活體內(nèi)主動(dòng)脈壁基因轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)研究 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1．X線透視下置人覆膜支架后造影顯示支架位置良好，主動(dòng)脈內(nèi)血流通暢，各主要血管分支顯示清晰。 2．動(dòng)物處死后尸檢見支架位置良好，無(wú)移位及明顯血栓形成。 3．X-gal染色：承載pCAGGS-LacZ覆膜支架處主動(dòng)脈壁染色

12、后可見散在深藍(lán)色點(diǎn)狀著色，證明具有β一半乳糖苷酶活性，承載pCAGGS的對(duì)照覆膜支架處主動(dòng)脈壁未見深藍(lán)色點(diǎn)狀著色。 4．X-gal染色后的標(biāo)本進(jìn)行HE染色，見主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞層損傷，只有少量?jī)?nèi)皮細(xì)胞殘存，大部分內(nèi)彈力板連續(xù)完整，個(gè)別處破損，中層平滑肌細(xì)胞排列整齊；無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及平滑肌細(xì)胞增殖，部分內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見深藍(lán)染色，另外個(gè)別內(nèi)彈力板受損處可見平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)深藍(lán)染色。 5．Rt-PCR檢測(cè)結(jié)果證實(shí)置人承載pC

13、AGGS-LacZ覆膜支架處主動(dòng)脈壁組織內(nèi)含有編碼β-半乳糖苷酶的mRNA。 6．覆膜支架置入處遠(yuǎn)端主動(dòng)脈、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟Rt-PCR結(jié)果均為陰性，證實(shí)無(wú)全身系統(tǒng)播散性基因轉(zhuǎn)染。 pCAGGS質(zhì)粒是理想的非病毒性基因轉(zhuǎn)染載體，LacZ可作為基因轉(zhuǎn)染的報(bào)告基因，其表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)方便易行。CGH涂覆聚酯纖維的血管內(nèi)覆膜支架是很有前途的基因轉(zhuǎn)染承載平臺(tái)，涂層材料與質(zhì)粒DNA通過電荷吸引形成穩(wěn)定復(fù)合物，在支架組裝與輸送過