NOS-NO系統(tǒng)活性在兔AMI心肌再灌注損傷中的作用及卡維地洛的干預(yù).pdf

1、背景：急性心肌梗死(AMI)為冠狀動(dòng)脈急性閉塞所致，其治療的關(guān)鍵是盡早行血運(yùn)重建，使梗死相關(guān)冠脈(IRCA)再通，減輕缺血再灌注損傷(IRI)，實(shí)現(xiàn)心肌水平的理想再灌注。 近年研究證實(shí)，第三代β受體阻滯劑卡維地洛通過阻滯鈣通道、抑制中性粒細(xì)胞浸潤、保護(hù)心肌細(xì)胞線粒體、抗血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、抗氧化、減少NO失活以及避免NO過量產(chǎn)生等機(jī)制在心肌缺血再灌注(IR)時(shí)起到重要的心肌保護(hù)作用。 目的：本研究采用阻斷及松解冠狀動(dòng)脈左回

2、旋支之左室支(LAVB)的方法建立兔AMI再灌注模型。通過觀察兔AMI再灌注后不同時(shí)間段一氧化氮合酶(NOS)活性、NO、白介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、丙二醛(MDA)含量及NOSmRNA表達(dá)水平的變化，探討兔AMI再灌注后NOS-NO系統(tǒng)活性的變化規(guī)律及卡維地洛的干預(yù)作用。本實(shí)驗(yàn)共分4部分。 方法與結(jié)果： 1. 兔AMI再灌注模型的建立：方法日本大白兔24只為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，體重2.5～3.5kg，

3、雌雄不拘。隨機(jī)分為缺血再灌注組、缺血未灌注組及假手術(shù)組，每組8只。沿胸部正中皮膚切口，暴露縱隔及心臟，充分顯露LAVB，首先進(jìn)行缺血預(yù)適應(yīng)阻斷左室支血流5min后松開10min，再次阻斷5min松開10min，再次阻斷60min，然后缺血再灌注組松解進(jìn)行再灌注，缺血未灌注組在穿線處結(jié)扎，假手術(shù)組只穿線不阻斷血流。整個(gè)造模過程行心電監(jiān)護(hù)及對(duì)癥處理，以保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活。3天后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取梗死區(qū)、梗死邊緣區(qū)、正常心肌組織備用。采兔術(shù)前(基

4、線水平)、再灌注后4、8、12、18、24、48、72小時(shí)靜脈血，檢測(cè)cTnI,CK和CK-MB：行心電圖觀察П，Ш，avF導(dǎo)聯(lián)ST段抬高振幅總和變化；行心肌組織病理學(xué)檢查、伊文思蘭及TTC染色評(píng)價(jià)心肌壞死情況。所有數(shù)據(jù)以STATA8.0軟件包進(jìn)行處理：計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，多樣本均數(shù)間多重比較應(yīng)用Scheffe檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料應(yīng)用X2檢驗(yàn)；相關(guān)變量間采用直線相關(guān)分析，以P

5、<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異。結(jié)果各組動(dòng)物冠脈閉塞前、后體表心電圖及冠脈阻斷后П,Ш,avF導(dǎo)聯(lián)ST段均抬高，缺血再灌注組松解后120分鐘內(nèi)ST段回落大于50％，而其它兩組無此表現(xiàn)。與術(shù)前相比，缺血再灌注組兔術(shù)后三項(xiàng)指標(biāo)均增高，且cTnI,CK和CK-MB酶峰分別提前至8h，12h和10h；缺血未灌注組三項(xiàng)指標(biāo)均增高，但無酶峰的前移；假手術(shù)組三項(xiàng)輕度升高，亦無酶峰的前移。缺血再灌注組及缺血未灌注組兔均符合2004中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分

6、會(huì)制定的《急性心肌梗死診斷和治療指南》AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)，心肌組織病理學(xué)及TTC染色亦支持AMI診斷；缺血再灌注組兔均符合1991年《中華心血管病雜志》編輯委員會(huì)推薦的判斷IRCA是否再通的標(biāo)準(zhǔn)，伊文思蘭注入結(jié)果亦支持IRCA的再通。 2. 兔AMI再灌注后NOS-NO系統(tǒng)活性的變化：方法日本大白兔24只為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，體重2.5～3.5kg，雌雄不拘，購自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物室。隨機(jī)分為缺血再灌注組(IR group)、缺血未灌注組(A

7、MI group)及假手術(shù)組(sham group)，每組8只。假手術(shù)組開胸穿線但不阻斷冠脈血流，其它兩組給予造模處理。成功建立動(dòng)物模型后采兔術(shù)前(基線水平)、再灌注后4、8、12、18、24、48、72小時(shí)靜脈血，檢測(cè)血清總NOS、誘導(dǎo)型NOS(iNOS)、內(nèi)皮型NOS(eNOS)活性及NO水平。行伊文思蘭及TTC染色測(cè)定壞死及缺血區(qū)心肌占左室重量比，并觀察NO與缺血壞死心肌重量比的相關(guān)性。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理同第一部分。結(jié)果各組觀察指標(biāo)基線水

8、平比較P>0.05；缺血再灌注組NO含量在4、8、24及48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)均高于缺血未灌注組(P<0.05)；缺血再灌注組NOS活性除72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)外均高于缺血未灌注組，在8、12、24、48、72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)NOS活性相比P<0.01；缺血再灌注組iNOS活性再灌注后各時(shí)間點(diǎn)均高于缺血未灌注組，4、8、12、24、48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)兩組相比P<0.01；缺血再灌注組NO含量各時(shí)間點(diǎn)均低于假手術(shù)組，除4小時(shí)時(shí)間點(diǎn)外兩組相比P<0.01；缺血再灌注

9、組NOS活性4小時(shí)時(shí)間點(diǎn)高于假手術(shù)組，而其它時(shí)間點(diǎn)低于假手術(shù)組(P<0.01)；缺血再灌注組iNOS活性各時(shí)間點(diǎn)均高于假手術(shù)組，除72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)外兩組相比P<0.01；缺血再灌注組再灌注后NO水平于4、8、12小時(shí)逐漸降低，于24小時(shí)增高后再次呈下降趨勢(shì)；NOS活性首先呈下降趨勢(shì)24小時(shí)增高而后各時(shí)間點(diǎn)繼續(xù)呈下降趨勢(shì)；缺血再灌注組再灌注后iNOS活性4小時(shí)開始升高24小時(shí)后呈下降趨勢(shì)；缺血未灌注組iNOS活性4小時(shí)開始升高而后至72小時(shí)

10、時(shí)間點(diǎn)一直呈升高趨勢(shì)。相關(guān)分析結(jié)果缺血再灌注組NO含量與壞死區(qū)心肌重量比例呈負(fù)相關(guān)(r=-0.8951。t=4.9175，p=0.0027)；NO含量與缺血區(qū)心肌重量比例亦呈負(fù)相關(guān)(r=-0.8368，t=3.7437，p=0.0096)。 3. 卡維地洛對(duì)兔AMI再灌注后NOS-NO系統(tǒng)活性的影響：方法日本大白兔24只為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，體重2.5～3.5kg，雌雄不拘，隨機(jī)分為對(duì)照組(control group)、干預(yù)組(treat

11、ment group)及假手術(shù)組(sham group)，每組8只。對(duì)照組僅給予造模處理，干預(yù)組予卡維地洛灌胃7天后造模，假手術(shù)組開胸穿線但不阻斷冠脈血流。成功建立動(dòng)物模型后采兔術(shù)前(基線水平)、再灌注后4、8、12、18、24、48、72小時(shí)靜脈血，檢測(cè)血清NO含量、總NOS、iNOS、eNOS活性及其mRNA表達(dá)水平；檢測(cè)cTnI,CK和CK-MB水平；行心電圖觀察П,Ш,avF導(dǎo)聯(lián)ST段抬高振幅總和變化；行血液動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)觀察左室舒

12、張末壓(LVEDP)、左室收縮末壓(LVESP)及平均動(dòng)脈壓(MABP)變化；觀察心肌組織學(xué)、心肌壞死及缺血區(qū)占左室重量比。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理同第一部分。結(jié)果各組觀察指標(biāo)基線水平比較P>0.05；干預(yù)組NO含量及NOS活性4、8、72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)高于對(duì)照組，而12、24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)低于對(duì)照組，除8小時(shí)時(shí)間點(diǎn)外兩組NO含量相比P<0.05，在4、8、12、24、48、72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)NOS活性干預(yù)組與對(duì)照組相比P<0.01；干預(yù)組iNOS活性再灌注后各

13、時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照組，在8、12、24、48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)相比P<0.01；干預(yù)組NO含量及NOS活性4、8小時(shí)時(shí)間點(diǎn)高于假手術(shù)組，而其它時(shí)間點(diǎn)低于假手術(shù)組(P<0.01)；干預(yù)組iNOS活性除24小時(shí)稍低外余時(shí)間點(diǎn)均高于假手術(shù)組，在4、12、48、72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)兩組比較P<0.01；iNOS活性于再灌注后4小時(shí)即開始升高24小時(shí)達(dá)峰值，NO及NOS除24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)升高外其它時(shí)間點(diǎn)均呈下降趨勢(shì)。干預(yù)組與對(duì)照組72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)心肌梗死邊緣組織eN

14、OS,iNOStuRNA表達(dá)相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.0000)。各組動(dòng)物冠脈閉塞前、后體表心電圖及冠脈阻斷后П，Ш,avF導(dǎo)聯(lián)ST段均抬高，對(duì)照組及干預(yù)組松解后120分鐘內(nèi)ST段回落大于50％，而假手術(shù)組無此表現(xiàn)。與假手術(shù)組比較，對(duì)照組及干預(yù)組兔術(shù)后cTnI,CK及CK-MB等反映心肌損傷的指標(biāo)均明顯升高，且酶峰分別提前至8，12及10小時(shí)。與假手術(shù)組比較，阻斷冠脈后對(duì)照組及干預(yù)組LVSP及MABP明顯降低，伴LVEDP明顯升高，

15、提示心肌收縮及舒張功能明顯受損。與對(duì)照組相比，干預(yù)組LVSP及MABP均較高，伴LVEDP減低，提示卡維地洛有改善心肌收縮及舒張功能作用。病理檢查干預(yù)組細(xì)胞腫脹及炎細(xì)胞浸潤均較對(duì)照組輕。伊文思藍(lán)及TTC染色結(jié)果顯示對(duì)照組及干預(yù)組的缺血區(qū)心肌占左心室比例分別為14.09％及10.31％，對(duì)照組及干預(yù)組的壞死區(qū)心肌占左心室比例分別為11.10％及8.01％，兩組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.0000)。 4. 兔AMI再灌注后N

16、OS-NO系統(tǒng)活性與血清IL-8、TNF-α、及MDA水平變化關(guān)系的研究：方法日本大耳兔24只，隨機(jī)分為干預(yù)組、對(duì)照組及假手術(shù)組，每組8只。冠狀動(dòng)脈夾閉60min后松解制備AMI后再灌注模型，對(duì)照組僅給予造模處理，干預(yù)組予卡維地洛灌胃7天后造模，假手術(shù)組開胸穿線但不阻斷冠脈血流。成功建立動(dòng)物模型后采兔術(shù)前(基線水平)、再灌注后4、8、12、18、24、48、72小時(shí)靜脈血，檢測(cè)血清NOS、iNOS、eNOS活性及NO，IL-8，TNF-

17、α，MDA水平。并觀察血清IL-8，TNF-α與iNOS活性的相關(guān)性，同時(shí)觀察MDA與NO的相關(guān)性。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理同第一部分。 結(jié)論： 1. 應(yīng)用本研究制模方法可成功建立兔AMI再灌注模型，成功率高； 2. 兔AMI再灌注早期由于NOS活性減低使兔血清NO水平降低，再灌注后期由于iNOS的活化使兔血清NO水平升高，兔AMI再灌注后NOS-NO系統(tǒng)活性變化與IRI有關(guān)，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，NO水平與心肌缺血壞死重量比呈負(fù)

18、相關(guān)； 3. 卡維地洛可以減少兔AMI再灌注后NO的失活及iNOS的活化，使NOS.NO系統(tǒng)活性維持在有利于心肌理想再灌注水平，從而減少兔AMI再灌注后心肌IRI，改善兔AMI再灌注后心肌收縮及舒張功能，減少兔AMI再灌注后心肌缺血壞死面積； 4. 干預(yù)組及對(duì)照組血清IL-8，TNF-α含量與iNOS活性呈正相關(guān)，MDA濃度與NO水平呈負(fù)相關(guān)；卡維地洛可以通過抑制炎癥介質(zhì)的釋放及清除氧自由基(OFR)調(diào)控NOS-NO系統(tǒng)