ILT2在結(jié)核患者NK細胞的表達及作用研究.pdf

1、結(jié)核病是引起死亡人數(shù)高居第二位的感染性疾病。由于耐藥結(jié)核的產(chǎn)生、艾滋病感染流行、人口流動和臨床免疫抑制劑的應(yīng)用增多等原因，全球結(jié)核病疫情非常嚴重，僅2012年，全球新發(fā)結(jié)核病例達860萬，有130萬人死于結(jié)核病，約45萬人為耐多藥結(jié)核病。我國現(xiàn)有活動性肺結(jié)核病人約500萬，每年約有13萬人死于結(jié)核病。盡管結(jié)核感染人數(shù)眾多，但是僅有5-10％的感染者發(fā)展成為活動性結(jié)核。研究結(jié)果表明，結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸不僅僅取決于結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量和

2、毒力，在很大程度上還取決于機體的免疫狀態(tài)。
　　宿主固有免疫在結(jié)核病早期發(fā)揮抗結(jié)核分枝桿菌感染作用，而且對于激發(fā)宿主獲得性免疫也發(fā)揮了重要作用。在結(jié)核分枝桿菌入侵早期，獲得性免疫未被充分激活之前，固有免疫系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌的控制和清除過程中發(fā)揮著重要作用。參與固有免疫細胞主要為NK細胞、巨噬細胞、單核細胞、嗜中性白細胞等，它們無須抗原預(yù)先致敏，主要通過釋放細胞因子、穿孔素、顆粒酶、表達配體等發(fā)揮作用，誘導免疫細胞聚集，殺傷靶細胞。

3、
　　NK細胞是參與抗結(jié)核固有免疫的重要細胞，具有細胞毒性效應(yīng)，能分泌IFN-γ等細胞因子，同時具有免疫調(diào)節(jié)的功能。為了保持抗感染免疫的平衡，NK細胞的功能由位于細胞表面不同的激活和抑制型受體共同進行調(diào)節(jié)。免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄子2（ILT2，又稱CD85j，LILRB1，LIR-1）是一種Ⅰ型轉(zhuǎn)膜蛋白，胞漿區(qū)含有四個免疫受體酪氨酸抑制性基序。該受體通過動員如SHP-1的Src同源結(jié)構(gòu)域(SH2)蛋白參與ITIM酪氨酸磷酸化的負信號調(diào)節(jié)

4、。ILT2在NK細胞、T細胞、B細胞、單核細胞和樹突細胞上均有表達，與MHC-I類分子(HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-E和HLA-G)結(jié)合，同時，ILT-2還能識別其他蛋白，如人類巨細胞病毒(HCMV)編碼的UL18蛋白。目前，ILT2在抗結(jié)核感染免疫中的作用尚不明確。為此，本論文開展了對ILT2在結(jié)核患者NK細胞的表達及作用的研究:
　　第一，研究NK細胞及亞群在肺結(jié)核患者外周血淋巴細胞的分布情況，研究ILT2在肺

5、結(jié)核患者NK細胞上的表達及與結(jié)核病情嚴重程度的關(guān)系。研究對象包含肺結(jié)核組(n=70)和健康對照組(n=67)，根據(jù)痰涂片或痰培養(yǎng)結(jié)果將肺結(jié)核組分為菌陽組(n=41)和菌陰組肺結(jié)核組(n=29)。
　　首先采集活動性肺結(jié)核組和健康對照組的新鮮外周EDTA抗凝血，密度梯度離心分離PBMCs，用熒光標記的抗人CD3、CD56、CD16進行染色，流式細胞術(shù)檢測CD3-CD56+NK細胞及兩個亞型CD3-CD56dimCD16+和CD3-C

6、D56bright CD16+/-的分布比例。研究結(jié)果顯示，活動性肺結(jié)核患者外周血淋巴細胞群中CD3-CD56+NK細胞的比例為2.3％（1.2％-4.0％），明顯低于健康對照組(7.8％;6.5％-11.9％)，p＜0.0001;活動性肺結(jié)核外周血淋巴細胞群中CD3-CD56dimNK細胞的比例(3.6％;2.2-6.7％)明顯低于健康對照組(9.2％;6.2-14.1％; p＜0.0001)，活動性肺結(jié)核組外周血淋巴細胞群中CD3-

7、CD56brightNK細胞的比例(0.3％;0.2-0.6％)較健康對照組(0.5％;0.3-0.6％)顯著下降(p=0.0002)。研究結(jié)果表明活動性肺結(jié)核患者外周血NK細胞及亞群的比例均明顯下降。
　　其次，采集肺結(jié)核組和健康對照組的新鮮外周EDTA抗凝血，密度梯度離心分離PBMCs，用熒光標記的抗人CD3、CD56、CD16和ILT2染色，流式細胞術(shù)檢測ILT2抗體在NK細胞不同亞群上的表達。實驗結(jié)果顯示，活動性肺結(jié)核患者

8、ILT2+CD56dimCD16+ NK細胞比例45.7％(33.9％-56.2％)明顯高于健康對照者19.1％(9.9-30.0％)，(p＜0.0001)。ILT2在活動性肺結(jié)核組CD56brightCD16+/-NK細胞上的表達比例為2.6％(1.4-4.9％)，與健康對照組CD56brightCD16+/-NK細胞表達的比例2.4％(0.7-5.7％)相似，結(jié)果無統(tǒng)計學意義(p=0.5163)。研究結(jié)果表明活動性肺結(jié)核患者外周血I

9、LT2+CD56dimCD16+ NK細胞表達比例明顯高于健康對照者。
　　此外，比較了ILT2在菌陽活動性肺結(jié)核組和菌陰活動性肺結(jié)核組D56dimCD16+-NK細胞上的表達，分析ILT2在肺結(jié)核患者NK細胞上的表達與結(jié)核病病情的關(guān)系。實驗結(jié)果顯示，ILT2在菌陽肺結(jié)核組CD56dimCD16+ NK細胞上的表達比例(55.3％;45.4-59.9％)明顯高于菌陰肺結(jié)核組(32.9％;23.3-42.0％)， p＜0.0001。

10、實驗結(jié)果表明ILT2在CD56dimCD16+ NK細胞上的表達水平與肺結(jié)核病的病情嚴重程度相關(guān)。
　　第二，通過研究ILT2表達與NK細胞CD107a表達的關(guān)系及ILT2表達與NK細胞分泌IFN-γ的關(guān)系，探究ILT2對肺結(jié)核患者NK細胞的細胞毒作用和干擾素分泌的影響。同時通過檢測ILT2+ CD56dimNK細胞的自然凋亡與ILT2-CD56dimNK細胞的自然凋亡以研究ILT2對NK細胞的自然凋亡作用。研究對象為38例活動性

11、結(jié)核患者，痰涂片或痰培養(yǎng)結(jié)果陽性。
　　首先，以K562細胞為靶細胞，以5∶1比例將15例活動性結(jié)核患者外周血單個核細胞與靶細胞K562共孵育，加入抗人CD107a熒光抗體。采用流式細胞術(shù)分析CD107a在ILT2+ CD56dimNK和ILT2-CD56dim NK細胞上的表達區(qū)別。實驗結(jié)果顯示，CD107a在ILT2+CD56dimCD16+ NK細胞的表達比例顯著低于ILT2-CD56dimmNK細胞(p=0.0169)。結(jié)

12、果表明ILT2在CD56dimNK細胞的表達與NK細胞細胞毒作用缺陷相關(guān)。
　　其次，采用胞內(nèi)染色方法，將10例活動性肺結(jié)核患者單個核細胞與靶細胞K562混合孵育，加入monensin，細胞表面熒光染色后，行細胞破膜，加入FITC-標記抗人IFN-γ單抗，流式細胞術(shù)檢測IFN-γ在ILT2+CD56dimNK細胞和ILT2-CD56dim NK細胞內(nèi)的表達。實驗結(jié)果顯示，IFN-γ在ILT2+CD56dimNK細胞的表達明顯少于I

13、LT2-CD56dimNK細胞(p=0.0038)。結(jié)果表明ILT2在CD56dim NK細胞的表達與NK細胞IFN-γ分泌水平降低相關(guān)。
　　此外，加入抗ILT2的阻斷抗體及同型對照抗體，將CD56dimCD16+ NK細胞與靶細胞K562進行孵育，流式細胞術(shù)檢測阻斷ILT2信號通路后CD107a在CD56dimCD16+ NK細胞上表達情況。實驗結(jié)果顯示，阻斷ILT2信號通路后，CD107a在CD56dimCD16+ NK細胞

14、上表達的比例較加入同型對照后明顯升高(p=0.0223)。結(jié)果表明阻斷ILT2信號通路可提高CD56dimCD16+NK細胞的細胞毒作用。
　　最后，采用AnnexinⅤ與PI雙染方法判定NK細胞自然凋亡，采用流式細胞術(shù)檢測，比較分析ILT2+CD56 dim NK細胞和ILT2-CD56 dimNK細胞的凋亡比率。實驗結(jié)果顯示，ILT2+CD56dim NK細胞的自然凋亡率顯著高于ILT2-CD56dimNK細胞(p=0.033

15、5)。研究結(jié)果表明ILT2可促進活動性肺結(jié)核患者CD56dimCD16+ NK細胞的自然凋亡。
　　本研究采用流式細胞術(shù)，開展了對ILT2在結(jié)核患者NK細胞的表達及作用的研究。研究發(fā)現(xiàn)，活動性肺結(jié)核患者外周血中NK細胞及亞群的分布比例均顯著下降;ILT2在活動性肺結(jié)核患者CD56dimCD16+NK細胞上的表達頻率升高，并與活動性結(jié)核病的病情嚴重程度相關(guān);ILT2對活動性結(jié)核患者CD56dimNK細胞的細胞毒作用和細胞因子分泌的功