局部應(yīng)用P物質(zhì)調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力促進(jìn)大鼠下頜骨牽張成骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨骼中有豐富的感覺神經(jīng)支配，這些神經(jīng)除了傳遞痛覺之外，還能夠分泌神經(jīng)遞質(zhì)P物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽等調(diào)控骨形成，為了研究外源性P物質(zhì)對(duì)牽張成骨中骨形成的影響及其機(jī)理，我們?cè)O(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)：
　　實(shí)驗(yàn)一：外源性P物質(zhì)對(duì)大鼠下頜骨牽張成骨的影響
　　目的：P物質(zhì)是感覺神經(jīng)纖維分泌的神經(jīng)肽，其具有調(diào)控骨形成的功能，但其對(duì)牽張成骨的影響，尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過局部注射10-7M的P物質(zhì)來研究P物質(zhì)對(duì)牽張大鼠下頜骨牽張成骨的影響。

2、　　方法：20只大鼠行右側(cè)下頜骨牽張成骨后經(jīng)過5天的延遲期，在牽張期10天中，每12小時(shí)牽張0.2mm，實(shí)驗(yàn)組在牽張期內(nèi)每日向牽張區(qū)注射0.2ml10-7M的P物質(zhì)溶液（對(duì)照組注射相同劑量的生理鹽水）；動(dòng)物分別在固定期第0、14天處死取材行Micro-CT檢測(cè)、HE染色。
　　結(jié)果：在術(shù)后15日，Micro-CT檢測(cè)骨密度結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p<0.05；術(shù)后29日，實(shí)驗(yàn)組的骨密度和骨體積分?jǐn)?shù)均高于對(duì)照組。HE

3、染色發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組的骨小梁結(jié)構(gòu)較對(duì)照組成熟，骨小梁面積高于對(duì)照組。
　　結(jié)論：局部注射10-7M的P物質(zhì)能夠促進(jìn)大鼠下頜骨牽張成骨新骨形成及成熟程度。
　　實(shí)驗(yàn)二外源性P物質(zhì)在牽張成骨中對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞動(dòng)員的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：實(shí)驗(yàn)一結(jié)果顯示局部注射10-7M的P物質(zhì)可以促進(jìn)大鼠牽張成骨中新骨形成，但其機(jī)制并不清楚，本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)牽張局部的間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和外周血中的CD29+細(xì)胞數(shù)目來研究外源性 P物質(zhì)在大鼠牽張成骨中對(duì)

4、間充質(zhì)干細(xì)胞的動(dòng)員影響。
　　方法：20只大鼠行右側(cè)下頜骨牽張成骨后經(jīng)過5天的延遲期，在牽張期10天中，每12小時(shí)牽張0.2mm，實(shí)驗(yàn)組在牽張期10天內(nèi)每日向牽張區(qū)注射10-7M的P物質(zhì)溶液0.2ml（對(duì)照組注射相同劑量的生理鹽水）；動(dòng)物分別在固定期第0、14天處死取材行Nestin免疫組織化學(xué)染色，并在手術(shù)后第術(shù)后5、6、11、15、22、29d經(jīng)鼠尾靜脈采血0.1ml經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血中的CD29+細(xì)胞數(shù)目。
　　結(jié)

5、果：Nestin免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組 Nestin陽(yáng)性細(xì)胞分布于牽張間隙中，而對(duì)照組主要位于微血管周圍；流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在術(shù)后第11、15、22天SP組外周血中的CD29+細(xì)胞明顯高于對(duì)照組（p<0.05），術(shù)后第29天實(shí)驗(yàn)組低于對(duì)照組（p<0.05）。
　　結(jié)論：局部注射10-7M的P物質(zhì)可以更有效的動(dòng)員間充質(zhì)干細(xì)胞向牽張區(qū)域遷移。
　　實(shí)驗(yàn)三局部應(yīng)用P物質(zhì)對(duì)大鼠下頜骨牽張成骨中SDF-1表達(dá)的影響
　　目

6、的：以上結(jié)果顯示局部注射10-7M的P物質(zhì)可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞動(dòng)員影響大鼠牽張成骨中新骨形成，而SDF-1的濃度對(duì)干細(xì)胞遷移起到重要作用。
　　方法：30只大鼠行右側(cè)下頜骨牽張成骨后經(jīng)過5天的延遲期，在牽張期10天中，每12小時(shí)牽張0.2mm，實(shí)驗(yàn)組每日向牽張區(qū)注射0.2ml10-7M的P物質(zhì)，對(duì)照組注射相同劑量的生理鹽水，動(dòng)物分別在術(shù)后第15天取材行SDF-1免疫組化染色，在術(shù)后第6、15、29天取材行實(shí)時(shí)定量PCR并在手術(shù)后第

7、6、11、15、29d經(jīng)鼠尾靜脈采血0.5ml后ELISA試劑盒檢測(cè)血漿中SDF-1濃度。
　　結(jié)果：免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記SDF-1后觀察到SP組SDF-1表達(dá)高于對(duì)照組；實(shí)時(shí)定量PCR和ELISA均顯示在術(shù)后第15天檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)組牽張區(qū)和外周中的SDF-1及其mRNA表達(dá)均處于峰值并明顯高于對(duì)照組（p<0.05）。
　　結(jié)論：局部注射10-7M的P物質(zhì)可以提高牽張區(qū)和外周血中SDF-1的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)四外源性P物質(zhì)對(duì)

8、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外遷移的影響
　　目的：上述實(shí)驗(yàn)說明，局部注射外源性的 P物質(zhì)可以增強(qiáng)局部和全身間充質(zhì)你干細(xì)胞的動(dòng)員，干細(xì)胞動(dòng)員后遷移到創(chuàng)傷區(qū)域也是干細(xì)胞參與牽張區(qū)新骨形成的重要一步，本實(shí)驗(yàn)研究外源性 P物質(zhì)對(duì)大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞體外遷移的影響。
　　方法：10只大鼠（80±20g，4周齡）處死后取雙側(cè)下頜骨剪碎后膠原酶消化法取原代細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，擴(kuò)充至第三代后流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定表面抗型進(jìn)行鑒定，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中含有10-7 M

9、P物質(zhì)，在接種后第1、3、5、7天取培養(yǎng)基行ELISA SDF-1濃度測(cè)定，并獲取細(xì)胞行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SDF-1mRNA表達(dá)，培養(yǎng)7日后鑒定表面CXCR4的表達(dá)，并行tranwell遷移實(shí)驗(yàn)比較細(xì)胞體外遷移能力。
　　結(jié)果：從下頜骨中分離的原代培養(yǎng)細(xì)胞呈梭型貼壁生長(zhǎng)，對(duì)第三代細(xì)胞表型經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定后發(fā)現(xiàn)CD90、CD29、CD44陽(yáng)性，CD34、CD45陰性，加入10-7M SP組，SDF-1及其mRNA表達(dá)均高于對(duì)照組（p

10、<0.05），培養(yǎng)7天后BMSCs表面CXCR-4表達(dá)倍增（p<0.05）,transwell遷移實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組（p<0.05）。
　　結(jié)論：外源性10-7M的P物質(zhì)在體外實(shí)驗(yàn)中可以促進(jìn)BMSCs分泌SDF-1，并增加BMSCs膜表面的CXCR4表達(dá)，同時(shí)可以增強(qiáng)BMSCs的體外遷移能力。
　　實(shí)驗(yàn)五外源性P物質(zhì)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖活性和成骨能力的影響
　　目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞受到機(jī)體

11、動(dòng)員后遷移到牽張間隙黏附于基質(zhì)網(wǎng)開始增殖和分化參與骨形成的過程，本實(shí)驗(yàn)觀察加入外源性 P物質(zhì)后大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖活性和成骨能力的變化。
　　方法：實(shí)驗(yàn)四培養(yǎng)的第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中含有10-7 M P物質(zhì)，培養(yǎng)3日后BrdU染色，14天后觀察集落形成，成骨分化中培養(yǎng)7天后加入含有P物質(zhì)的成骨誘導(dǎo)液，分別在1、7、14天檢測(cè)堿性磷酸酶活性、ALP、Runx2的mRNA表達(dá)，第14天茜素紅染色。
　　結(jié)果：