調(diào)控微環(huán)境改善大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨再生效能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨缺損修復(fù)的前提條件，如何提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨缺損區(qū)域再生中發(fā)揮的作用，是研究缺損修復(fù)的核心問題。我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，利用骨組織工程支架材料搭載小干擾RNA及局部應(yīng)用神經(jīng)肽等多種方法調(diào)控細(xì)胞微環(huán)境，進(jìn)而提高大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移，分化和增殖能力。
　　實(shí)驗(yàn)一殼聚糖搭載兩種小干擾RNA對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨成血管分化的作用
　　目的：將兩種分別促進(jìn)成骨和成血管的siRNA同時(shí)搭載到殼聚糖凝膠中，制成新的

2、骨組織工程支架材料，研究此種新型支架材料對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用。
　　方法：制備殼聚糖凝膠，用脂質(zhì)體2000搭載siCkip-1和siFlt-1、單獨(dú)搭載siCkip-1、單獨(dú)搭載siFlt-1，搭載siNC導(dǎo)入殼聚糖凝膠中，將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種至之前4組搭載siRNA的支架材料及不搭載任何siRNA的殼聚糖凝膠中，觀察這五組支架材料對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化的作用。
　　結(jié)果： RT-qPCR分析顯示

3、siCkip-1+siFlt-1組中ALP、OCN以及VEGF的表達(dá)顯著高于其余四組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），免疫熒光染色的結(jié)果顯示，siCkip-1+siFlt-1組的 osteocalcin和von Willebrand factor高表達(dá)，顯著高于其余4組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　結(jié)論：siCkip-1和siFlt-1同時(shí)載入殼聚糖會(huì)發(fā)生協(xié)同作用，顯著增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨成血管能力。
　　實(shí)驗(yàn)二體

4、內(nèi)植入搭載兩種小干擾RNA的殼聚糖對(duì)大鼠顱骨缺損修復(fù)的作用
　　目的：將實(shí)驗(yàn)一中的已經(jīng)證實(shí)可以在體外促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨成血管的支架材料植入大鼠體內(nèi)，研究其對(duì)顱骨缺損修復(fù)的作用。
　　方法：將實(shí)驗(yàn)一中制備的5組支架材料分別植入15只大鼠的顱骨缺損區(qū)域，三個(gè)月后處死大鼠，Micro-CT三維重建骨缺損區(qū)域，分析新生骨組織的骨密度和骨體積分?jǐn)?shù)。Van Gieson染色觀察骨組織變化。
　　結(jié)果：siCkip-1+siF

5、lt-1組與其余4組相比，顯著提高缺損區(qū)骨的再生（P＜0.05）。
　　結(jié)論：殼聚糖搭載siCkip-1和siFlt-1所構(gòu)建的骨組織工程支架材料能夠促進(jìn)大鼠骨缺損的再生修復(fù)。
　　實(shí)驗(yàn)三 CGRP對(duì)大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞遷移，增殖和成骨分化的影響
　　目的：SDF-1在細(xì)胞遷移的過程中發(fā)揮重要作用，因而我們研究 CGRP對(duì)體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌SDF-1的作用，以及CGRP對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移，增殖和成骨分化的影

6、響。
　　方法：將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別接種在CGRP濃度為10-7M的培養(yǎng)基、CGRP8-37濃度為10-7M的培養(yǎng)基以及普通培養(yǎng)基中，ELISA檢測(cè)三組BMSCs中SDF-1的分泌和表達(dá)，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組BMSCs的遷移能力，BrdU免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組BMSCs的增殖能力，RT-qPCR檢測(cè)三組BMSCs的成骨相關(guān)基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：每組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)BMSCs都有SDF-1mRNA的分泌和表達(dá)，而在第

7、3、5天時(shí)，三組之間兩兩都有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三組均有穿膜 BMSCs，CGRP組的穿膜細(xì)胞顯著多于對(duì)照組，對(duì)照組顯著多于CGRP8-37組，兩兩之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），BrdU染色顯示CGRP組中處于DNA合成期的細(xì)胞顯著多于對(duì)照組，而對(duì)照組的陽性細(xì)胞亦顯著多于CGRP8-37組，且兩兩之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。三組BMSCs每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有ALPmRNA和Runx2表達(dá)，在

8、14天時(shí)達(dá)到峰值 CGRP組顯著高于其余兩組，對(duì)照組顯著高于CGRP8-37，兩兩之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　結(jié)論：體外實(shí)驗(yàn)中，CGRP對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移，增殖和成骨分化有促進(jìn)作用。
　　實(shí)驗(yàn)四局部注射降鈣素基因相關(guān)肽CGRP對(duì)SD大鼠下頜骨單側(cè)牽張成骨效果的影響
　　目的：利用局部注射CGRP的方式研究CGRP對(duì)于大鼠牽張成骨效果的影響。
　　方法：30只大鼠全麻下右側(cè)下頜骨植入牽張器并

9、截?cái)嘞骂M骨，隨機(jī)分為三組，在牽張期10天中，分別局部注射0.2ml10-7M濃度CGRP、CGRP8-37及生理鹽水。固定2周后處死動(dòng)物，Micro-CT分析新生骨密度及骨體積分?jǐn)?shù)，HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)。
　　結(jié)果：Micro-CT分析結(jié)果顯示三組牽張區(qū)均有不同程度的新骨形成，三維重建后分析BMD以及BV/TV，CGRP組明顯高于其它兩組，且兩兩間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。HE染色顯示三組動(dòng)物牽張區(qū)均有新骨形成，而 CGR

10、P組骨小梁顯著多于其余兩組，且兩兩間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　結(jié)論：局部注射外源性 CGRP可以促進(jìn)牽張區(qū)骨再生。
　　實(shí)驗(yàn)五局部注射CGRP對(duì)下頜骨牽張中間充質(zhì)干細(xì)胞動(dòng)員的作用
　　目的：通過檢測(cè)牽張時(shí)局部間充質(zhì)干細(xì)胞和外周血中間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量，以及SDF-1的表達(dá)，來研究局部應(yīng)用CGRP對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞動(dòng)員的作用。
　　方法：手術(shù)同實(shí)驗(yàn)四，在牽張器植入5、6、11、15、22、29天，流式細(xì)胞法

11、檢測(cè)外周血CD29陽性細(xì)胞數(shù)量，ELISA檢測(cè)外周血SDF-1含量，qRT-RCR檢測(cè)牽張區(qū)SDF-1mRNA的表達(dá)。并在處死動(dòng)物后，免疫組化檢測(cè)新生骨區(qū)Nestin表達(dá)。
　　結(jié)果：CGRP組牽張區(qū) Nestin陽性細(xì)胞顯著多于其余兩組，SDF-1mRNA表達(dá)亦顯著高于其余兩組，兩兩之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。術(shù)后5、6、11、15、22、29天六個(gè)時(shí)間點(diǎn)采得的外周血均有CD29陽性細(xì)胞，均有SDF-1的表達(dá)，且在達(dá)到峰值