VGSCs在小鼠巨噬細(xì)胞系表型偏移及高脂血癥背景下循環(huán)和主動(dòng)脈斑塊內(nèi)單核-巨噬細(xì)胞亞群表型調(diào)節(jié)中的作用.pdf

1、研究目的:單核/巨噬細(xì)胞是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，作為免疫系統(tǒng)的第一道防線，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。單核/巨噬細(xì)胞是一個(gè)具有異質(zhì)性的群體，根據(jù)單核/巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物的差異表達(dá)，可分為不同的亞群，且各細(xì)胞亞群在疾病的病理過(guò)程中發(fā)揮著不同的作用。近期有研究顯示小鼠機(jī)體內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞亞群的變化會(huì)影響許多心血管疾病的病理進(jìn)展，提示維持機(jī)體單核/巨噬細(xì)胞不同亞群的平衡可能是這些疾病治療的潛在靶點(diǎn)。苯妥英鈉(phenytoin，PHT)為

2、非選擇性電壓門(mén)控鈉通道(voltage gated sodium channels，VGSCs)阻斷劑，早期流行病學(xué)研究顯示長(zhǎng)期服用苯妥英鈉的癲癇患者其冠心病的患病率明顯低于對(duì)照組。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為VGSCs主要存在于可興奮細(xì)胞中（神經(jīng)元、心肌和骨骼?。?，近年研究顯示VGSCs亦存在于巨噬細(xì)胞等非可興奮細(xì)胞中，并參與其生物表型的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)室在近期工作中發(fā)現(xiàn)VGSCs在小鼠外周血單核細(xì)胞中也有表達(dá)。因此，我們提出以下假說(shuō)，VGSCs參與了單

3、核/巨噬細(xì)胞亞群的表型調(diào)節(jié)，而VGSCs阻斷劑苯妥英鈉可以通過(guò)影響單核/巨噬細(xì)胞亞群的平衡，降低炎癥反應(yīng)，繼而發(fā)揮心血管保護(hù)作用。
　　研究?jī)?nèi)容與方法:第一部分采用免疫磁珠分選技術(shù)純化小鼠外周血Ly6G-CD11b+單核細(xì)胞，采用real-time PCR法檢測(cè)電壓門(mén)控型鈉通道α亞單位(NaV1.1-NaV1.9和NaVX)以及β亞單位(Scnlb-Scn4b)的相對(duì)表達(dá)豐度:第二部分采用real-timePCR法檢測(cè)小鼠RAW2

4、64.7巨噬細(xì)胞系中VGSCs各亞型的表達(dá)豐度，確定與單核細(xì)胞共表達(dá)，且豐度高的VGSCs亞型;隨后采用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)將特定RNAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞，經(jīng)Hygromycin B篩選后獲得低表達(dá)特定VGSCs亞型的穩(wěn)定細(xì)胞株。對(duì)穩(wěn)定細(xì)胞株進(jìn)行如下檢測(cè):1）Real-time PCR檢測(cè)干擾效率;2）CCK-8法測(cè)定增殖活性:3）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和吞噬能力;4）Transwe

5、ll法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力;5）經(jīng)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和白介素4(interleukin-4，IL-4)誘導(dǎo)后，real-timePCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞表型偏移相關(guān)標(biāo)志物（M1:iNOS; M2:Arg-1）的mRNA表達(dá)水平;6）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VGSCs特定亞型敲低細(xì)胞株及VGSCs阻斷劑PHT干預(yù)后細(xì)胞周期的變化。第三部分以6-8周齡雄性C57BL/6J和ApoE/-小鼠作為研究對(duì)象，隨機(jī)分為高脂飲食組和正

6、常飲食組，10周后，高脂飲食組再隨機(jī)分為PHT和生理鹽水兩個(gè)亞組，正常飲食組給予生理鹽水，繼續(xù)喂養(yǎng)4周，分別在10周和14周應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血單核細(xì)胞（Ly6Chi:Ly6G-CD11b+Ly6Chi，Ly6C1o:Ly6G-CD11b+Ly6Clo）和主動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞不同亞群(Ly6ChiF4/80+:CD45+CD11b+F4/80+Ly6Chi，Ly6CloF4/80+:CD45+CD11b+F4/80+Ly6Clo

7、)的比例變化;ELISA法檢測(cè)各處理組小鼠血漿中甘油三酯和總膽固醇的水平。
　　結(jié)果:1）小鼠外周血單核細(xì)胞表達(dá)的VGSCs亞型有:NaV1.1、NaV1.3、NaV1.4、NaV1.5、NaV1.6、NaV1.7、NaV1.8、NaV1.9、NaVX、Scn1b、Scn2b、 Scn3b和Scn4b; RAW264.7細(xì)胞中表達(dá)的VGSCs亞基有:NaV1.1、NaV1.3、NaV1.4、NaV1.5、NaV1.6、NaV1.7

8、、NaV1.9和NaVX，且NaV1.4和NaV1.9的表達(dá)豐度最高。2）我們以NaV1.4為RNAi靶點(diǎn)，建立低表達(dá)NaV1.4的RAW264.7穩(wěn)定細(xì)胞株，real-time PCR法鑒定干擾效率約75％。低表達(dá)NaV1.4可以顯著降低RAW264.7細(xì)胞的吞噬和遷移能力，抑制LPS誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS表達(dá)的升高，促進(jìn)IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Arg1表達(dá)的升高，但對(duì)細(xì)胞的增殖活性無(wú)明顯影響。PHT可抑制RAW

9、264.7細(xì)胞的增殖活性，并隨藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用增強(qiáng)。3）高脂飲食可增加外周血Ly6Chi單核細(xì)胞亞群和主動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)Ly6ChiF4/80+巨噬細(xì)胞的比例，灌胃給予小鼠PHT和生理鹽水4周后，與生理鹽水組相比，PHT組Ly6Chi單核細(xì)胞亞群和Ly6ChiF4/80+巨噬細(xì)胞亞群比例顯著降低，而Ly6Clo單核細(xì)胞亞群和Ly6CloF4/80+巨噬細(xì)胞則呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)。4）高脂飲食增加機(jī)體總膽固醇和甘油三酯的水平，PHT