人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)外對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞表型及IL-10表達(dá)的影響研究.pdf

1、目的：
　　探討人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）在體內(nèi)外對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞表型及IL-10表達(dá)的影響，求證hAMSC是否具有調(diào)控小鼠巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及促進(jìn)IL-10表達(dá)的作用，以完善hAMSC促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制研究，為進(jìn)一步轉(zhuǎn)化到臨床提供基礎(chǔ)研究資料。
　　方法：
　　1、產(chǎn)婦知情同意后采集足月剖宮產(chǎn)羊膜，采用胰酶-膠原酶二步消化法分離hAMSC

2、s，差速貼壁，DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)、純化，傳代至P4代，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活的OD值，繪制培養(yǎng)1-7天生長(zhǎng)曲線，采用流式細(xì)胞儀鑒定并成脂及成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)hAMSCs。
　　2、腹腔灌洗法提取10只C57BL/6野生小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL，每孔1mL接種于6孔培養(yǎng)板，去除未貼壁細(xì)胞后使用含INF-γ（M1型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)劑）的DMEM培養(yǎng)基2mL培養(yǎng)，細(xì)胞吞噬試驗(yàn)鑒定。
　　3、小鼠腹腔

3、巨噬細(xì)胞培養(yǎng)5天后移除6孔板內(nèi)含INF-γ的DMEM培養(yǎng)基，設(shè)立hAMSCs共培養(yǎng)組及單獨(dú)培養(yǎng)組，每組3孔， hAMSCs共培養(yǎng)組每孔加入1×104個(gè)P4代hAMSCs（hAMSCs巨噬細(xì)胞比為1:10）后予DMEM培養(yǎng)基2mL培養(yǎng)，單獨(dú)培養(yǎng)組予DMEM培養(yǎng)基2mL培養(yǎng)。ELISA法于共培養(yǎng)后1天、7天檢測(cè)各組上清液中IL-12（M1型巨噬細(xì)胞型分泌）、Arg-I（M2型巨噬細(xì)胞型分泌）及IL-10含量，并根據(jù)各組不同時(shí)間點(diǎn)上清液IL-

4、12、Arg-I的含量分析hAMSCs對(duì)巨噬細(xì)胞表型變化的影響。
　　4、取56只雄性健康C57BL/6野生小鼠建立背部全層皮膚缺損模型，剔除小鼠背部毛發(fā)，在脊柱兩側(cè)分別設(shè)計(jì)并切除10mm×10mm大小正方形全層皮膚。設(shè)立hAMSCs移植組及對(duì)照組，每組28只，hAMSCs移植組小鼠于每個(gè)背部創(chuàng)面周圍多點(diǎn)皮下注射以DMEM培養(yǎng)基配制濃度為1×106個(gè)/100μL的P4代hAMSCs細(xì)胞懸液100μL，對(duì)照組小鼠于每個(gè)背部創(chuàng)面注射1

5、00μL DMEM培養(yǎng)基。
　　5、取2只雄性健康C57BL/6野生小鼠建立背部全層皮膚缺損模型，創(chuàng)面周圍多點(diǎn)注射100μL細(xì)胞密度為1×106個(gè)/100μL CM-Dil標(biāo)記的hAMSCs細(xì)胞懸液，14天后切取創(chuàng)面組織，熒光顯微鏡下對(duì)移植hAMSCs進(jìn)行示蹤。
　　6、小鼠背部皮膚缺損模型建立后1天、3天、7天、14天觀察各組小鼠創(chuàng)面愈合情況，測(cè)量創(chuàng)面面積，計(jì)算每組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)愈合率。并于以上各時(shí)間點(diǎn)擴(kuò)大切取創(chuàng)面組織，組織石

6、蠟切片HE染色觀察炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)情況；冰凍切片免疫熒光雙染色分別觀察組織中CD68與iNOS雙陽(yáng)性(M1型巨噬細(xì)胞)、CD68與Arg-I雙陽(yáng)性(M2型巨噬細(xì)胞)表達(dá)情況；qPCR檢測(cè)創(chuàng)面組織抗炎因子IL-10基因的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、采用胰酶-膠原酶二步消化法可獲得大量穩(wěn)定增殖的hAMSCs。hAMSCs原代接種48h可見(jiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)， P4代hAMSCs細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”形，3-5天呈指數(shù)生長(zhǎng)期，然后進(jìn)入平

7、臺(tái)期，細(xì)胞停止增殖。流式細(xì)胞鑒定：細(xì)胞表面CD73（98.1％）、CD90（96.7%）、CD105（95.1%）呈陽(yáng)性，CD45、CD34、CD11b、CD19、HLA-DR陰性（0.5%）。細(xì)胞成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后行油紅O染色可見(jiàn)紅色脂滴，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后行茜素紅染色可見(jiàn)紅色鈣化結(jié)節(jié)。
　　2、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞呈圓形或橢圓形、梭形、不規(guī)則形，細(xì)胞表面伸出許多刺毛狀小突起，并對(duì)墨汁顆粒具有吞噬作用，吞噬百分率為85%。

8、>　　3、ELISA法檢測(cè)hAMSCs共培養(yǎng)組1天、7天上清液IL-12濃度分別為43.36±1.93ng/L、22.22±1.47ng/L，Arg-I濃度分別為5.48±1.38 U/L、12.52±0.46 U/L，IL-10濃度分別為65.35±5.99 ng/L、220.69±7.11ng/L；單獨(dú)培養(yǎng)組1天、7天上清液IL-12濃度分別為42.74±2.42ng/L、33.08±1.10ng/L，Arg-I濃度分別為5.13±

9、0.48 U/L、6.07±0.13 U/L；IL-10濃度分別為62.48±2.17 ng/L、75.54±7.50 ng/L。可見(jiàn)第7天hAMSCs共培養(yǎng)組上清液IL-12濃度較巨噬細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組低，而上清液中 Arg-I、IL-10含量較巨噬細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組高（P＜0.05）。提示體外培養(yǎng)過(guò)程中hAMSCs能促進(jìn)小鼠M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化及IL-10分泌。
　　4、hAMSCs移植組1天、3天、7天、14天創(chuàng)面愈合

10、率分別為（1.23±0.39）%、（33.93±2.71）%、（75.17±3.69）%、（98.14±1.66）%；對(duì)照組1天、3天、7天、14天創(chuàng)面愈合率分別為（1.11±0.11）%、（27.29±3.41）%、（62.37±5.24）%（95.46±2.56）%?？梢?jiàn)hAMSCs移植組創(chuàng)面3天、7天、14天創(chuàng)面愈合率優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.05）。
　　5、hAMSCs移植后14天所取組織冰凍切片于熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)hAMSC

11、s移植組中存在散在熒光分布，提示局部移植的hAMSCs在建模14天后依舊存活。
　　6、HE染色圖片觀察可見(jiàn)創(chuàng)面愈合3天、7天hAMSCs移植組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)模型對(duì)照組少。
　　7、免疫熒光染色結(jié)果顯示hAMSCs移植組1天、3天、7天、14天的CD68與iNOS雙陽(yáng)性細(xì)胞百分比分別是（36.84±5.52）%、（32.73±3.56）%、（18.17±1.33）%、（5.41±2.19）%， CD68與 Arg-I雙陽(yáng)性

12、細(xì)胞百分比分別是（2.08±1.04）%、（30.18±4.13）%、（38.74±3.71）%、（21.01±1.75）%；模型對(duì)照組1天、3天、7天、14天的CD68與 iNOS雙陽(yáng)性細(xì)胞百分比分別是（37.29±6.78）%、（43.97±2.98）%、（23.31±2.51）%、（6.51±1.28）%，CD68與Arg-I雙陽(yáng)性細(xì)胞百分比分別是（1.59±1.54）%、（23.58±1.66）%、（31.06±2.61）%、（

13、18.71±1.58）%?？梢?jiàn)hAMSCs移植組M1型巨噬細(xì)胞陽(yáng)性率在3天、7天低于模型對(duì)照組，M2型巨噬細(xì)胞陽(yáng)性率在3天、7天高于模型對(duì)照組（P＜0.05），提示hAMSCs局部移植能促進(jìn)小鼠創(chuàng)面M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
　　8、qPCR檢查結(jié)果顯示小鼠背部皮膚全層缺損模型建立后hAMSCs移植組1天、3天、7天、14天創(chuàng)面組織IL-10基因相對(duì)GAPDH基因表達(dá)量分別為0.0152±0.0025、0.2827±0.

14、0133、0.0535±0.0054、0.0209±0.0055；模型對(duì)照組1天、3天、7天、14天創(chuàng)面組織IL-10基因相對(duì)GAPDH基因表達(dá)量分別為0.0127±0.0021、0.1208±0.0043、0.0326±0.0046、0.0148±0.0021?？梢?jiàn)對(duì)照組及模型組相比3天、7天hAMSCs移植組創(chuàng)面組織IL-10的基因表達(dá)高于模型對(duì)照組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、hAMSCs在體內(nèi)外具有調(diào)控小鼠