轉生長激素基因奶山羊安全性評價.pdf

1、近些年，轉基因技術發(fā)生了迅猛的發(fā)展，為了快速提高經濟動物的生產性能，科學家們制備了越來越多的轉基因動物。通過轉入外源基因改變生產性能的轉基因動物是否會對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成威脅，這一問題在科學界和社會上一直存在這比較大的爭議。因此，全方位多角度的對未上市的轉基因動物進行安全性評價，對人類社會的和諧發(fā)展以及生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要的意義。
　　本實驗室前期通過體細胞核移植技術，成功的制備了提高奶產量的轉生長激素(growth hor

2、mone， GH)基因奶山羊。本試驗以轉GH基因奶山羊為研究目標，從自身安全、環(huán)境安全和食品安全角度來評價其安全性。首先，通過高通量轉錄組測序技術比較泌乳期的轉GH基因奶山羊和非轉基因奶山羊乳腺的基因表達水平，來評價轉GH基因奶山羊的自身安全性;然后，采集轉GH基因奶山羊的糞便和腸道內容物以及轉基因羊場內環(huán)境土壤為樣本，檢測樣品中樣品基因組中外源基因GH和neo的漂移情況，進而通過PCR-DGGE方法分析樣品中菌群結構，進行轉GH基因奶

3、山羊的環(huán)境安全性評價;最后，通過飼喂SD大鼠來評價轉GH基因羊奶的食品安全性，主要檢測了轉GH基因羊奶對SD大鼠的生長發(fā)育、免疫水平以及行為狀態(tài)的影響。主要試驗分為以下四個階段:
　　1轉GH基因奶山羊泌乳期乳腺基因表達水平的變化
　　轉基因動物的安全性評價體系中，對轉基因動物自身安全的評價是重要的一環(huán)，這關系到轉基因動物制備成功與否的關鍵。轉GH基因奶山羊轉入的是乳腺特異性表達的山羊生長激素基因，因此轉基因山羊乳腺發(fā)育的變

4、化是否會對動物體的健康造成隱患，需要進一步的研究。本試驗通過轉錄組測序方法，比較轉GH基因奶山羊泌乳期乳腺組織基因水平與非轉基因奶山羊的差別。并選擇15個與生長激素影響乳腺發(fā)育相關的基因，通過qRT-PCR方法進一步驗證。結果表明，轉GH基因奶山羊乳腺中過表達的生長激素雖然能夠促進乳腺細胞的過量增殖，但是動物機體通過自身的調節(jié)可以將乳腺的增殖保持在健康水平，證明了轉GH基因奶山羊能夠健康的生長發(fā)育。
　　2轉GH基因奶山羊外源基因

5、漂移檢測
　　在評價轉基因動物安全性的過程中，環(huán)境安全性評價是必不可少的一環(huán)，而外源基因漂移的檢測又是環(huán)境安全性評價的重中之重。本部分試驗的研究目的是通過PCR擴增反應對轉GH基因奶山羊的腸道內容物、糞便和環(huán)境土壤中細菌基因組進行檢測，以確定是否發(fā)生基因漂移事件。首先，分別采集轉生長激素奶山羊和非轉基因奶山羊的腸道內容物和糞便以及羊場內部和附近的土壤作為樣品，然后利用商業(yè)化的基因組提取試劑盒提取樣品中存在的細菌基因組，在針對制備轉

6、GH基因奶山羊的載體設計檢測引物，最后通過PCR擴增反應驗證樣品基因組中是否存在外源基因。檢測的結果顯示，轉GH基因奶山羊的腸道內容物樣品、糞便樣品以及環(huán)境土壤樣品中的細菌基因組均未檢測到外源的山羊生長激素基因以及neo基因。這些結果證明了，轉GH基因奶山羊外源基因整合狀態(tài)穩(wěn)定，沒有發(fā)生基因漂移事件。
　　3轉GH基因奶山羊對環(huán)境菌群結構的影響
　　轉基因動物在養(yǎng)殖生產階段是否會對周圍環(huán)境物種造成影響一直是社會和科學界關注的

7、焦點，而評價周圍環(huán)境菌群結構是轉基因動物環(huán)境安全性評價的重要指標。本研究的目的是評價轉GH基因奶山羊對周圍環(huán)境菌群結構的影響。首先通過PCR擴增方法得到轉GH基因奶山羊的糞便、腸道內容物和環(huán)境土壤樣品中細菌基因組的16srDNA基因V3區(qū)域片段;然后通過PCR-DGGE方法將不同序列的DNA片段分離，并將分離出來的條帶進行回收純化;最后將回收的DNA片段進行測序，并提交到GenBank數據庫進行Blast比對，得到細菌種屬信息。PCR-

8、DGGE電泳相似性數據分析表明，各類樣品的相似度在95％以上;各樣品的菌群種屬統(tǒng)計數據顯示，各樣品的優(yōu)勢菌群相同，整體菌群機構分布趨勢一致。這些結果表明，轉GH基因奶山羊的存在，對其生存空間存在的微生物菌群結構并沒有造成顯著性的差異。從環(huán)境安全性方面考慮，轉GH基因奶山羊并沒有展現出破壞環(huán)境中生物多樣性的特性。
　　4轉GH基因羊奶食品安全性評價
　　在評價轉基因動物安全性時，轉基因動物產生的食品同樣要進行安全性評價。因此，

9、本試驗通過飼喂動物試驗來評價轉GH基因奶山羊產出的羊奶的食品安全性。本試驗將60只大鼠分成三組，分別飼喂轉GH基因羊奶、正常羊奶以及生理鹽水，飼喂周期為90天。飼喂期間每天觀察記錄大鼠的生活習性，并定期稱量體重;采集各組大鼠的血液樣品進行血常規(guī)檢測和血清生化檢測;用ELISA試劑盒檢測血清中免疫相關指標IL-2、IgG、IgE和IFN-γ的水平;90天后對大鼠進行剖檢，對主要臟器進行稱重以及組織病理切片觀察。各項檢測結果顯示，轉GH基因